重组疫苗E.coli LLO/OVA经TLR4和NOD1受体诱导树突状细胞表达细胞因子

【摘要】 　　目的: 探讨树突状细胞(DC)的模式识别受体(PPRs)活化与细胞因子表达的关系。方法: 采用基因芯片及RTPCR检测经E.coli LLO/OVA刺激后小鼠骨髓树突状细胞（bone marrowderived dendritic cell， BMDC）的PPRs及其下游NFκB信号通路相关分子mRNA的表达水平， 并观察BMDC的活化状况及培养上清液内细胞因子含量。结果: 经E.coli LLO/OVA刺激后2 h， BMDC出现短暂的TLR4 mRNA 表达上调， 其下游信号途径相关的Myd88、 Rip2、 Irak1、 Irak2、 Ikkα、 NFκB1和NFκB2 mRNA均出现表达上调， 黏附分子Icam1、 细胞因子IL1a、 IL1b、 IL6和TNFα的mRNA也表达上调; 经E.coli LLO/OVA刺激后4 h， BMDC出现Card4(NOD1) mRNA表达上调， 其下游信号途径相关的Rip2、 Ikkβ、 NFκB1和NFκB2 mRNA均出现表达上调， IFNγ、 TNFβ和CD40 mRNA也上调表达。经E.coli LLO/OVA刺激后24 h， BMDC表达共刺激分子及MHCII类分子上调; 且培养上清液内IL12和IFNγ含量增高。结论: 重组疫苗E.coli LLO/OVA经TLR4和NOD1受体激活NFκB信号通路， 诱导了小鼠BMDC成熟并表达一系列细胞因子尤其是IL12和IFNγ。

【关键词】 骨髓树突状细胞; 重组大肠杆菌; 模式识别受体; 基因芯片

　　［Abstract］ AIM: To investigate the relationship between the activation of pattern recognition receptors and the cytokines expression of dendritic cells. METHODS: After bone marrowderived dendritic cells (BMDCs) were pulsed by E.coli LLO/OVA， the mRNA expression of pattern recognition receptors and the downstream NFκB signal pathway associated molecules were detected by microarray hybridization and RTPCR; the expression of costimulatory molecules， MHC class Ⅱ and cytokines were determined by flow cytometry and ELISA. RESULTS: After BMDCs were pulsed by E.coli LLO/OVA for 2 h， the levels of TLR4， Myd88， Rip2， Irak1， Irak2， Ikkα， NFκB1 and NFκB2 mRNA upregulated; and the levels of Icam1， IL1a， IL1b， IL6 and TNFα mRNA upregulated also; after BMDCs were pulsed by E.coli LLO/OVA for 4 h， the levels of Card4(Nod1)，　　Rip2， Ikkβ， NFκB1 and NFκB2 mRNA upregulated， meanwhile， the levels of TNFγ， TNFβ and CD40 mRNA upregulated. The expressions of costimulatory molecules and MHC class Ⅱ of the BMDCs upregulated and the concentration of IL12 and IFNγ increased in the supernatant of BMDCs pulsed by E.coli LLO/OVA at 24 h. CONCLUSION: Recombinant E.coli LLO/OVA induces maturation and expression of cytokines， especially IL12 and IFNγ， of murine BMDCs through activation of NFκB signal pathway with TLR4 and NOD1 receptors.

　　［Keywords］bone marrowderived dendritic cell (BMDC); recombinant E.coli; pattern recognition receptors (PPRs); microarray

　　树突状细胞（dendritic cells， DC）在诱导和调节机体的获得性免疫和天然免疫中发挥了重要作用， 因此肿瘤疫苗能否有效的活化DC是决定疫苗免疫效果的关键。DC能通过其模式识别受体（pattern recognition receptors， PPRs）识别病原相关模式分子而活化成熟， 从而诱导天然免疫和调节获得性免疫。Toll样受体（tolllike receptors， TLR）是最主要的PPR， 目前已发现TLR1TLR13的13个TLR家族成员， 它们多分布于细胞膜， 且每一成员识别特有的模式分子， 如TLR2识别革兰氏阳性菌的糖肽， 而TLR4识别革兰氏阴性菌菌壁的脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）。TLR家族可通过依赖Myd88的信号途径活化NFκB介导MHCⅡ类分子和共刺激分子表达， 同时也促进炎性细胞因子的分泌， 此外文献还报道TLR4的活化介导了抗肿瘤免疫［1， 2］。近年来研究发现细胞内的PPR核苷酸连接的寡聚化域（nucleotidebinding oligomerization domain， NOD）受体， 如NOD1和NOD2受体在识别细胞质内的分子后， 也能经NFκB信号途径诱导DC产生细胞因子从而启动天然免疫， 并与TLR信号途径协同诱导Th1细胞的产生［3， 4］。我们采用非致病性大肠杆菌携带模型肿瘤抗原卵白蛋白（ovalbumin， OVA）和李斯特溶素O（Listeriolysin O， LLO) 构建的重组疫苗E.coli LLO/OVA体外刺激DC， 用基因芯片杂交和RTPCR等方法检测E.coli LLO/OVA刺激DC TLR和NOD受体及其下游NFκB信号途径相关分子活化与细胞因子表达的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 TRIzol RNA提取试剂和琼脂糖购自Invitrogen公司。Rneasy迷你柱购自Qiagen公司。Taq Man逆转录试剂盒购自Roche公司。去内毒素的PBS buffer， RPMI1640由Cancer research UK提供。重组鼠GMCSF购自Pepritech公司。TrulabelingAMPTM Linear RNA扩增试剂盒、 Oligo GEArray鼠NFκB 信号通路基因芯片购自Supperarray公司。PCR引物由Sigma公司合成。FITC连接的抗鼠CD40， CD80， CD86 和 IAb(MHCII)荧光抗体购自BD Pharmingen公司。鼠IL12和IFNγ ELISA试剂盒购自BD Biosciences公司。 6～8周龄雌性C57BL/6小鼠， 体质量20～25 g， 购自英国Harlan公司， 于无菌环境饲养。实验前处死小鼠取其股骨和胫骨骨髓细胞， 培养于RPMI1640培养液（含10 mL/L小牛血清， 重组小鼠GMCSF 6 ng/L）。培养第4天弃去悬浮细胞并更换培养液， 继续培养至第7天， 收集悬浮的BMDC用于实验。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细菌菌株及培养 单克隆含LLO和OVA基因片段质粒的重组E.coli LLO/OVA， 仅含OVA基因片段质粒的重组E.coli OVA经含选择性抗生素的LB液体培养基37℃摇床培养过夜后， 加入4 mmol/L 的IPTG诱导LLO和OVA的合成， 当培养液A600达到1时收集细菌， 经Western blot验证LLO和/或OVA的表达后， 分装储存于-80℃备用。E.coli LLO/OVA和E.coli OVA用前均用5 g/L多聚甲醛室温固定30 min， 经去内毒素的PBS 洗3次后， 重悬为1012细菌/L， 4℃冰箱储存备用。

　　1.2.2 BMDC的培养和细菌刺激 将前述的小鼠BMDC（2×109/L）与E.coli LLO/OVA （1011/L）或E.coli OVA(1011/L)按BMDC∶细菌≈1∶5的比例混合， 于培养管内用RPMI培养液（加入100 mL/L小牛血清）37℃， 50 mL/L CO2孵育60 min; 加入庆大霉素50 mg/L杀灭细胞外细菌， 洗涤并重悬细胞于RPMI培养液（加入100 mL/L小牛血清和庆大霉素50 mg/L）继续培养; 分别于2、 4、 6、 8 h后收集细胞用于提取RNA， 24 h后收集细胞及上清用于流式细胞术和ELISA检测。

　　1.2.3 Supperarray探针的合成和杂交 BMDC的总RNA (3 μg)经逆转录后， 按Supperarray公司的Oligo GEArray TrulabelingAMPTM Linear RNA扩增试剂盒说明书合成生物素标记的cRNA探针。 6 μg的cRNA探针与鼠NFκB 信号通路基因芯片在杂交炉内60℃杂交18 h， 经Buffer I 和Buffer II洗涤后， 加入Solution G于杂交炉内37℃孵育40 min， 再加入APSA Buffer孵育10 min， CDPStar孵育5 min后取出芯片， 在暗盒内用KODAK胶片覆盖芯片曝光10～15 min并冲洗胶片; 扫描仪扫描曝光后的胶片， 所得图片经Superarray 公司GEArray expression 分析软件分析杂交结果。

　　1.2.4 RTPCR 分别将经E.coli LLO/OVA和E.coli OVA刺激后2， 4， 6， 8 h的BMDC提取的2 μg总RNA， 用Taq Man逆转录试剂于42℃， 50 min合成cDNA后， 用PCR 50 μL扩增体系扩增Tlr4和Nod1(Card4)的cDNA。RTPCR中所用引物如下: Tlr4(439 bp)F5′GGAAGGACTATGTGATGTGACC3′， R 5′GCTCTTCTAGACCCATGAAATTGG3′; Card4/Nod1 (469 bp) F 5′CTTGCATTCAATGGCATCTC3′， R 5′ACATCGGTGTGCACTGTGGA3′; Gapdh (496 bp) F 5′TGATGGGTGTGAACCACGAG3′， R 5′TCAGTGTAGCCCAAGATGCC3′。反应体系扩增条件如下: 于94℃变性5 min后， 94℃变性45 s、 55℃复性45 s、 72℃延伸45 s共30个循环， 最后72℃再延伸10 min。于12 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带。
　　
　　1.2.5 细胞因子检测 按试剂盒操作说明向测定板孔内分别加入50 μL IL12或 IFNγ标准、 控制液和BMDC培养上清液， 于室温孵育2 h并用Buffer洗涤5次后， 加入100 μL连接反应液于室温孵育2 h并洗涤5次后， 加入显色反应液室温避光孵育30 min; 　终止反应后在酶标仪上测定A450值。

　　1.2.6 细胞表面分子检测 分别收集E.coli LLO/OVA或E.coli OVA刺激24 h后的BMDC， 将细胞密度调整为1×105细胞/80 μL ， 分别加入FITC连接的抗CD40、 CD80、 CD86和MHCII (IAb)抗体， 4℃避光孵育30 min; FACS Buffer 洗3次后重悬细胞进行流式细胞术检测。

　　1.2.7 统计学分析 采用SAS8.0 软件student’s t test进行统计学分析， P&<0.05具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 重组疫苗E.coli LLO/OVA经TLR4和Card4（NOD1）活化BMDC 小鼠NFκB基因芯片杂交结果显示经E.coli LLO/OVA刺激后2 h， BMDC出现短暂的TLR4 mRNA表达上调， 其下游信号途径相关的Myd88、 Rip2、 Irak1、 Irak2、 Ikkα、 NFκB1和NFκB2 mRNA均出现表达上调， 黏附分子Icam1、 细胞因子IL1a、 IL1b、 IL6和TNFα的mRNA也出现表达上调; 经E.coli LLO/OVA刺激后4 h， BMDC出现Card4（NOD1）mRNA及其下游信号途径相关的Rip2、 Ikkα、 Ikkβ、 NFκB1和NFκB2 mRNA表达上调， 同时IFNγ、 Lta(TNFβ)和TNFsf5(CD40) mRNA也表达上调（图1）。
　　
　　RTPCR结果也证实BMDC在受E.coli LLO/OVA刺激后2 h出现TLR4 mRNA表达上调， 且表达水平略高于E.coli OVA刺激的BMDC; BMDC经E.coli LLO/OVA刺激后4～8 h NOD1(Card4)mRNA持续表达上调， 而BMDC 仅在被E.coli OVA刺激6 h后出现Nod1(Card4)mRNA表达上调（图2）。

　　图1 BMDC经E.coli LLO/OVA刺激后的基因表达（略）

　　Fig 1 The mRNA expression of murine BMDC pulsed by E.coli LLO/OVA

　　2.2 BMDC上调表达共刺激分子和MHCII类分子 在E.coliLLO/OVA刺激后24 h， BMDC上调表达共刺激分子CD40、 CD80、 CD86及MHCⅡ类分子， 尤其CD40明显表达上调。但E.coli LLO/OVA与E.coli OVA刺激的BMDC共刺激分子和 MHCⅡ类分子表达差异无统计学意义（图3）。

　　图2 RTPCR检测BMDC的TLR4和 Nod1mRNA表达（略）

　　Fig 2 TLR4 and Nod1 mRNA expression of murine BMDC determinated by RTPCR

　　1: Nave BMDC; 2-5 BMDC pulsed by E.coli LLO/OVA 2， 4， 6， 8 h; 6-9: BMDC pulsed by E.coli OVA 2， 4， 6， 8 h.

　　2.3 E.coli LLO/OVA刺激BMDC分泌IL12和IFNγ ELISA结果显示经疫苗刺激后24 h的BMDC培养上清内IL12含量维持较高水平， 但E.coli LLO/OVA与E.coli OVA刺激后的BMDC分泌的IL12水平无差别。而E.coli LLO/OVA刺激后12 h和24 h的BMDC分泌IFNγ的水平明显高于E.coli OVA刺激后的BMDC（P&<0.05， 图4）。

　　图3 流式细胞术检测BMDC共刺激分子和MHCⅡ类分子表达（略）

　　Fig 3 Costimultory molecules and MHC class Ⅱ expression of BMDC detected by flow cytomytory

　　3 讨论
　　
　　DC经PPR识别特有的配基分子后， 经下游的NFκB信号途径诱导自身活化并表达共刺激分子和细胞因子， 在促进T细胞的活化和增殖中发挥重要作用。
　　
　　我们在实验中观察到经重组E.coli LLO/OVA刺激后， BMDC出现早期短暂的TLR4 mRNA转录上调， 同时其下游信号途径分子基因Myd88、 Irak1、 Irak2、 Ikkα、 NFκB1和NFκB2也表达上调， 该结果与文献报道TLR4经MyD88/NFκB信号途径活化DC相一致［5］。尽管G-菌菌壁成分LPS能诱导DC的TLR4表达， 但小鼠DC受LPS刺激后仅极低水平表达TLR4［6］， 本实验中BMDC经E.coli LLO/OVA刺激后出现较高水平的TLR4基因转录， 且转录水平高于E.coli OVA刺激的BMDC， 提示E.coli LLO/OVA具有更强的活化TLR4的作用。当BMDC经E.coli LLO/OVA刺激4 h后， 细胞质内受体NOD1基因Card4出现转录上调， 同时Rip2、 Ikkβ、 NFκB1、 NFκB2和IFNγ mRNA也出现转录上调， 提示NOD1及下游RIP2/IKK/NFκB信号途径活化与BMDC上调IFNγ表达有关。因LLO的穿孔素作用能破坏DC的溶酶体膜、 促进肿瘤抗原进入细胞质， 故推测E.coli LLO/OVA所携带的LLO不仅可促进肿瘤抗原进入细胞质， 使其易于经MHC分子提呈给T细胞， 也可通过激活胞质内受体NOD1而促进IFNγ的表达， Nakayama等［7］也证实LLO在介导IFNγ的分泌中发挥了重要作用。

　　图4 ELISA检测BMDC培养上清液细胞因子含量（略）

　　Fig 4 ELISA determined cytokine concentration in supernatant of BMDC

　　aP&<0.05 vs E.coli OVA.

　　ELISA结果显示经E.coli LLO/OVA刺激后24 h的BMDC培养上清液内IL12和IFNγ含量明显增高， 尤其IFNγ含量明显高于E.coli OVA刺激后24 h的BMDC培养上清液。文献也报道经TLR4活化的DC分泌IL12， 且NOD1与TLR4活化能协同诱导IL12、 IFNγ分泌和Th1细胞分化［4， 8］。IL12是促进Th0细胞分化为Th1的关键因子， 在诱导机体抗肿瘤免疫中发挥了重要作用［9］; INFγ既能通过自分泌促进DC细胞成熟、 诱导机体的天然免疫， 也能通过上调肿瘤细胞表面的MHC I分子而增强抗原提呈、 与IL12共同促进CD8+T分化为CTL， 从而刺激机体的获得性细胞免疫［10， 11］。实验中还观察到E.coli LLO/OVA刺激的BMDC经TLR4和NOD1受体活化后， 不仅上调了黏附分子ICAM表达， 而且还上调共刺激分子CD40、 CD80、 CD86和MHCII类分子的表达。Brzoza等［12］报道细胞质内的LLO在促进DC共刺激分子表达中起关键作用， 但本实验结果显示E.coli LLO/OVA和E.coli OVA均能诱导BMDC上调表达CD40、 CD80、 CD86和MHCII类分子， 提示LLO与BMDC的共刺激分子表达无明显关系。
　　
　　本实验结果显示携带了免疫佐剂LLO的重组E.coli LLO/OVA较仅携带模型肿瘤抗原OVA的E.coli OVA能更有效地活化BMDC的TLR4 和NOD1及下游NFκB信号途径， 促进一系列细胞因子表达， 尤其是Th1型细胞因子IL12和IFNγ的表达。

　　致谢: 作者在本课题实验中得到英国伦敦Queen Mary大学分子肿瘤研究所Georges Vassaux 博士的指导和大力支持， 在此表示衷心地感谢。

参考文献

　　［1］ Takada K， Akira S. Microbial recognition by Tolllike receptors［J］. J Dermatol Sci， 2004， 34(2): 73-82.

　　［2］ Okamoto M， OhE G， Oshikawa T， et al. Tolllike receptor 4 mediates the antitumor host response induced by a 55kilodalton protein isolated from Aeginetia indica L.， a parasitic plant［J］. Clin Diagn Lab Immunol， 2004， 11(3): 483-495.

　　［3］ Strober W， Murray PJ， Kitani A， et al. Signalling pathways and molecular interactions of NOD1 and NOD2［J］. Nat Rev Immunol， 2006， 6(1): 9-20.

　　［4］ Tada H， Aiba S， Shibata K， et al. Synergistic effect of NOD1 and NOD2 agonists with tolllike receptor agonists on human dendritic cells to generate interlukine12 and T helper type 1 cells［J］. Infect Immun， 2005， 73(12): 7967-7976.

　　［5］ Akira S， Takada K. Tolllike receptor signalling［J］. Nat Rev Immunol， 2004， 4(7): 499-511.

　　［6］ Rissi RJ， Muralimohan G， Maxwell JR， et al. Staphylococcal enterotoxins condition cells of the innate immune system for Tolllike receptor 4 stimulation［J］. Int Immunol， 2004， 16(12): 1751-1760.

　　［7］ Nakayama Y， Suda T， Nagata T， et al. Induction of protective immunity to Listeria monocytogenes with dendritic cells retrovirally transduced with a cytotoxic T lymphocyte epitope minigene［J］. Infect Immun， 2003， 71(4): 1748-1754.

　　［8］ Lapteva N， Seethammagari MR， Hanks BA， et al. Enhanced activation of human dendritic cells by inducible CD40 and Tolllike receptor4 ligation［J］. Cancer Res， 2007， 67(21): 10528-10537.

　　［9］ Hutter KG， Breuer SK， Paul P， et al. Generation of potent antitumor immunity in mice by interleukin 12secreting dendritic cells［J］. Cancer Immunol Immunother， 2005， 54(1): 67-77.

　　［10］ Pan J， Zhang M， Wang J， et al. Interferongamma is an autocrine mediator for dendrtic cell matureation［J］. Immunol Lett， 2004， 94(1-2): 141-151.

　　［11］ Shankaran V. IFNγ and lymphocytes prevent primary tumor development and shape tumor immunogenicity［J］. Nature， 2001， 410(6832): 1107-1111.

　　［12］ Brzoza KL， Rockel AB， Hiltbold EM. Cytoplasmic entry of Listeria monocytogenes enhances dendritic cell maturation and T cell differentiation and function［J］. J Immunol， 2004， 173(4): 2641-2651.