穿孔素在乙肝有关性肾炎的表达及意义

【摘要】 目的： 通过探测PFP在HBV相关性肾炎的肾组织的表达，以了解PFP介导的细胞毒作用在HBVGN发病中的意义. 方法： 10例HBVGN活检肾组织，冰冻切片采用免疫组化法（Elivision）的方法检测HBVGN肾活检组织中的perforin的表达. 结果： 在HBVGN肾组织内perforin在2/10的肾小球表达， 3/10在肾小管阳性表达，7/10肾间质表达. Perforin在肾小球与肾间质的表达差异有统计学意义(P=0.014，P&<0.05). 肾间质病变轻，中，重度间得Perforin表达差异无统计学意义(P&<0.05). 结论： HBVGN的发病过程中，CD8+ CTL介导的perforin途径，可能起到一定的作用.
【关键词】 穿孔素 乙型肝炎病毒 肾小球肾炎
　　0引言
　　目前HBV病毒在HBV相关性肾小球肾炎（HBVrelated glomerulonephritis，HBVGN）发病中的作用愈来愈受倒大家的重视. 杀伤性T细胞是乙肝发病过程中引起病理损伤的重要免疫活性细胞，穿孔素(perforin， PFP)是免疫活化细胞杀伤靶细胞的主要介质之一. 研究发现CD8＋CTL特异的细胞毒效应，由穿孔素介导，可以引起感染细胞损伤和死亡. 如果在肾组织中发现PFP蛋白质水平的表达则能反映活化免疫细胞与肾损害的关系，我们通过检测穿孔素在HBVGN肾组织中分布，初探穿孔素在HBVGN致病过程中的作用.
　　1对象和方法
　　1.1对象
　　所有病例均来自200402/200411在西安交通大学第一医院肾内科就诊的门诊和住院患者共10（男7，女3）例，平均27.5岁. 均经肾穿刺活检，确诊为HBVGN者. 同时排除了继发性肾小球疾病的患者. HBVGN的诊断标准如下：①血清HBV标志物阳性；②患肾小球肾炎，并除外狼疮性肾炎等继发性肾小球疾病；③肾组织切片中可找到HBV抗原（必备条件）. 此标准符合《乙型肝炎病毒相关性肾炎座谈会纪要》的标准. 另取5(男3，女2)例正常对照肾组织，来自因组织配型不合不宜移植的供肾体.
　　1.2试剂
　　鼠抗人PFP单克隆抗体为Novocastra Laboratories公司产品（产品编号：141002）. 即用型第二代免疫组化ElivisionTM Plus广谱试剂盒和DAB均购自福建迈新生物技术公司.
　　1.3免疫组化法(Elivision)
　　检测肾组织内PFP表达4 μm冰冻切片，吹干，PBS冲洗3×3 min， 3 mL/L双氧水室温下孵育10 min，PBS冲洗3×3 min；2 mL/L羊血清处理切片，室温下30 min，吸取羊血清，分别加入Ⅰ抗体（PFP稀释度1∶20），室温下孵育1 h，PBS冲洗3×5 min；每切片加50 μL聚合物增强剂，室温下孵育20 min，PBS冲洗3×3 min，吸干PBS；加入Ⅱ抗，室温下孵育30 min；PBS冲洗3×3 min；DAB室温下显色5-10 min；苏木精复染核，脱水，透明，封固. 阴性对照片用PBS代替Ⅰ抗.
　　1.4结果判断
　　perforin抗体阳性细胞表现为胞浆内棕黄色点状或环状分布，分为肾小球及肾小管间质区域，随机计算5个肾小球横切面内表达perforin的阳性细胞数然后取平均值，即为肾小球横切面平均阳性细胞数；在肾小管间质区域随机计算5个高倍镜视野(400×)内表达perforin的阳性细胞数然后取平均值，即为该区域平均阳性细胞数. 阳性强度分为0~3级(分别评分0～3分). 0：无细胞着色为阴性. 1：&<0.25细胞明显着色为弱阳性. 2： 0.25~0.5为阳性. 3：&>0.5为强阳性. 阴性对照组织无上述阳性反应.
　　1.5肾小管间质活动性指数
　　肾小管间质病理改变半定量积分参照Austin［2］标准. 肾小管间质病变包括：①肾小管变性、坏死；②肾间质炎症细胞浸润. 以上病变根据范围及严重程度分别记0～3分. 按无、轻、中、重度记0，1，2，3分. 无明显病变记0分，小灶性(≤0.25)记1分，片灶性（&>0.25，≤0.5）记2分，弥漫性(≥ 0.5)记3分. 肾小管间质活动性指数为（1）（2）项积分之和. 轻度肾小管间质病变为1～2分，中度肾小管间质病变为3～4分，重度肾小管间质病变为5～6分.
　　统计学处理: 数据采用SPSS11.5软件进行分析处理. 免疫组化半定量所得数据以中位数和四分位数间距描述，等级分组资料采用秩和检验. P&<0.05有统计学意义.
　　2结果
　　Perforin在正常的肾小球，肾小管及间质均无表达（图1）. perforin在HBVGN的肾脏组织内2/10在肾小球表达，但阳性表达较弱，半定量分析以0～1分为主（图2），3/10在肾小管阳性表达（图3），阳性表达半定量评分均为：2分；7/10在肾间质表达（图4），棕黄色阳性颗粒主要表达在肾间质细胞浆内，阳性表达半定量评分中位数为2，四分位数间距为0. Perforin在肾小球与肾间质的表达差异有统计学意义(P=Elivision ×1000.014，P&<0.05). 肾间质轻，中，重度兵病变间Perforin表达差异无统计学意义.
　　3讨论
　　HBVGN指临床上出现肾炎的表现，同时肾组织中找到乙型肝炎病毒抗原，并除外狼疮性肾炎等其他继发性因素的一类肾小球肾炎. 目前HBV病毒在HBVGN的发病中的作用愈来愈受倒大家的重视，冯江敏等［3］用原位核酸杂交技术在26例肾活检组织中，发现8例HBVDNA阳性，并且发现阳性者可见肾小管上皮细胞浆内、肾小球内皮细胞、肾间质小动脉壁平滑肌细胞浆及某些浸润的炎性细胞浆内均可见茶色粗颗粒沉积. 从而进一步证明了肾组织上不仅有HBV Ag，还有HBV DNA存在，而且揭示了HBV DNA可以存在于肾组织细胞浆内，这种浆形HBV DNA是单股DNA，是HBV DNA复制过程中的中间产物，据此推测HBV DNA在肾脏有原位复制的可能. 同时发现肾脏HBV DNA阳性的细胞周围75%的病例伴大量细胞浸润，与阴性组相差显著，并可见成簇的肾小管上皮细胞变性坏死，提示HBV诱导了细胞免疫的发生.
　　Chisari等［4］用HBV基因转移小鼠模型作体内研究证明，HBV特异性细胞毒性T细胞（CTL）在肝内是通过复合抗病毒免疫反应途径清除肝内HBV. 穿孔素（PFP）是一种存在于CTL和NK细胞胞浆细胞毒颗粒中的糖蛋白［5］，是CTL杀伤靶细胞的主要毒性蛋白，CTL介导的细胞毒作用之一就是通过穿孔素途径引起靶细胞的坏死. 有研究发现：在慢性乙肝的肝损害中，穿孔素介导的杀伤性T细胞毒作用发挥了重要的作用［6］. 细胞毒性T细胞(CTL)在慢性乙肝发病过程中能够引起病理损伤，细胞毒性T细胞(CTL)应答的广度和力度决定病毒感染短暂或持续、肝细胞损伤轻微或严重，而且CD8＋CTL特异的细胞毒效应，可由穿孔素介导，引起感染的细胞损伤和死亡［7］. 马路等［8］发现HBVMN的患儿的肾间质存在局灶CD4＋和CD8＋阳性的细胞浸润. 我们的研究发现中，perforin的表达主要在HBVGN的肾间质，在肾小球及肾小管的表达较弱. 肾间质的穿孔素的表达较肾小球强. 以上的结果提示在HBVGN的肾小球，肾小管和间质中，存在着CTL炎细胞的浸润. 在HBVGN的发病过程中，CD8＋阳性的CTL介导的perforin途径，可能起到一定的作用. perforin在HBVGN的肾间质损害过程中的作用，仍需增加样本量后进一步的观察.

参考文献

　　［1］Rapani JA，Smyth MJ．Functional significance of the perforin/granzyme cell death pathway［J］．Nat Rev Immunol，2002，2(10)： 735-747.

　　［2］王均玉，李幼姬，叶任高，等．68例狼疮性肾炎的肾小管间质病变探讨［J］．中华肾脏病杂志，1999，15：82-84.

　　［3］冯江敏，周希静，任青，等．用原位核酸杂交技术探讨乙型肝炎病毒对肾组织的致病作用［J］．中华肾脏病杂志，1995，11(2):107-109.

　　［4］Chisari V．Hepatitis B virus transgenic mice:insights into the virus and the disease［J］．Hepatology，1995，22：1316-1325.

　　［5］Rochel N，Cowan JA．Dependence of the lytic activity of the Nterminal domain of human perforin on membrane lipid compositionimplications for Tcell selfpreservation［J］． Eur J Biochem，1997，249(1)：223-231.

　　［6］Cerny A，Chisari FV. Pathogensis of chronic hepatitis C: Immunological features of hepatic injury and viral persistence［J］．Hepatology，1999，30(3)：595-601.

　　［7］骆抗先．乙型肝炎基础和临床［M］．2版．北京:人民卫生出版社，2001：152-153.

　　［8］马路，潘涛，杨琪，等．小儿乙肝相关膜性肾病患者小管间质改变的研究［J］．中国中西医结合肾病杂志，2003，4(3): 159-160.