关于P27kip1和Skp2在食管癌中的表达

　　　　　　　　 作者：宋旭东 李志强 朱海燕

【摘要】 目的：探讨p27Kip1，Skp2蛋白在食管癌发生、恶性增殖及转移扩散中的作用及二者间的相互关系. 方法：运用免疫组织化学EnVision法检测p27Kip1，Skp2蛋白在97例食管癌、30例食管癌旁组织标本中的表达情况. 结果：P27kip1与Skp2蛋白的阳性表达率在癌旁组(93.33%， 0%)与食管癌组(45.36%， 48.45%)，淋巴结转移阳性组(31.71%， 63.41%)与阴性组(55.36%， 37.50%)，高分化组(62.96%， 29.63%)与中(42.22%， 53.33%)，低分化组(32.00%， 60.00%)之间差异有显著性（P&<0.01），而与食管癌肿瘤的大小、性别、患病年龄和临床分期无关（P&>0.05）. 结论：p27Kip1，Skp2蛋白表达与食管癌的分化程度及淋巴结的转移状况有关，分化程度低者或伴随有淋巴结转移者，p27Kip1蛋白表达明显降低，相反，Skp2蛋白则明显增高，而且二者呈负相关.
【关键词】 P27kip1 Skp2 食管肿瘤
　　0引言
　　目前的研究表明恶性肿瘤细胞增殖失控是细胞周期校正点控制紊乱的结果. P27kip1是细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子（cyclindependent kinase inhibitor，CKI）家族的成员， S期激酶伴随蛋白2（Sphase kinaseassociated protein 2，SKP2）是泛素蛋白酶降解途径中Fbox蛋白家族中一员，而P27kip1的水解则主要是通过泛素蛋白酶体途径完成. 因而，研究p27kip1，Skp2蛋白在食管癌中的表达，探讨二者在食管癌细胞增殖、转移中的作用及相互关系，对揭示食管癌发生、发展的机制意义重大.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　1.1.1标本来源
　　标本均源于华北煤炭医学院附属医院200201/200410手术切除标本，所有标本术前均未经任何放化疗和其它抗肿瘤治疗. 其中食管癌标本97例，癌旁食管组织30例（距癌组织≥5 cm，经病理证实无癌细胞）. 所有病例的临床资料及病理资料完整，包括病灶的大小、组织学分型与分级、淋巴结转移、TNM分期等内容. 食管癌的临床分期依照1976年全国拟定的食管癌临床病理分期标准，组织分型与分级标准采用1990年WHO食管癌的分型及分级标准. 其中高分化27例，中分化45例，低分化25例. 组织学分型食管鳞癌91例，腺癌6例.
　　1.1.2主要试剂
　　鼠抗人p27kip1单克隆抗体、鼠抗人Skp2单克隆抗体及即用型EnVision免疫组化试剂盒均购于福州迈新生物技术开发有限公司.
　　1.2方法
　　组织切片经脱蜡至水后，参照说明书内容行EnVision免疫组化染色. 采用试剂盒内已知阳性的食管癌切片做阳性对照，以PBS代替一抗做空白对照. 结果参照Tanaka等的判定标准，以免疫组织化学记分值作为阳性的评判标准. 记分值的算式为H=N×I. N代表随机观察的10个高倍镜视野中平均阳性细胞数记分. 平均阳性细胞数＜10%为0分，10%~29%为1分，30%~59%为2分，60%~74%为3分，≥75%为4分. I代表着色强度记分值，1分：弱（+，淡黄色），2分，中等（，棕黄色），3分：强（，深棕黄色）. 显色强度与背景无明显差别者为阴性. 若H＞1为阳性，若H≤1则为阴性.
　　统计学处理：实验结果采用SPSS12.0统计学软件进行分析处理，采用方差分析组间差异、卡方检验二者之间的相关性. P＜0.05为差别有统计学意义.
　　2结果
　　2.1P27kip1，Skp2蛋白在食管癌及癌旁食管上皮中的表达
　　P27kip1，Skp2蛋白染色主要位于细胞核，部分胞质Skp2染色阳性，极少部分胞质P27kip1染色阳性，染色呈粗细不一的黄色至深棕黄色颗粒（图1，2）. 97例食管癌中，P27kip1蛋白阳性者44例，Skp2蛋白阳性者47例；30例癌旁食管组织中，有28例P27kip1蛋白阳性表达，而Skp2蛋白均为阴性. 统计分析显示P27kip1蛋白在食管癌中阳性率明显低于在癌旁食管组织的阳性率(P&<0.01)，Skp2蛋白在食管癌组织中阳性率则明显高于癌旁食管组织(P&<0.01).
　　2.2P27kip1，Skp2蛋白在各临床病理观察组中的表达
　　P27kip1蛋白在有淋巴结转移的食管癌组织中的阳性率为31.71%（13/41），在无淋巴结转移组的食管癌组织中的阳性率为55.36%（31/56）. P27kip1蛋白表达阳性率在淋巴结转移阴性组中明显高于淋巴结转移阳性组(表1). P27kip1蛋白在高、中、低三组分化程度不同的食管癌组织中的阳性率呈依次降低，其中低等分化和中等分化组的阳性率较高等分化组显著降低(表1). 在各年龄组、临床分期组、性别和瘤体大小组间，P27kip1蛋白和Skp2蛋白阳性表达率差异无统计学意义(P&>0.05).表1P27kip1，Skp2蛋白在各临床病理观察组中的表达（略）
　　2.3P27kip1与Skp2蛋白在食管癌中表达的相关性
　　47例Skp2阳性的食管癌患者中有32例P27kip1阳性表达（32/47），阳性率为68.08%，在50例Skp2阴性的食管癌患者中P27kip1阳性表达者12例（12/50），阳性率为24.00%，列联表交互作用检验χ2=19.00，P&<0.01，两变量有交互作用.
　　3讨论
　　P27kip1是在1994年由Polyak等［1］发现的一种细胞周期负性调控因子. P27kip1主要是通过其N端的两个丝氨酸化位点与细胞周期蛋白cyclinECDK2和/或cyclinDCDK4紧密结合，抑制CDK激酶的活性，发挥抑制细胞周期的作用，使细胞阻滞于G1期［2］. 现已证实［3］ P27kip1存在于大多数的哺乳动物细胞中，在真核细胞周期调控中起至关重要的作用. Skp2是新发现的SKP1CullinFbox（SCF）多功能E3酶复合体中的一种Fbox蛋白，在许多细胞周期调控因子的泛素依赖性蛋白水解途径中起到特异性识别底物的作用，从而参与细胞周期的调控［4］.
　　
　　本研究结果显示正常食管上皮细胞P27kip1蛋白的阳性表达率（93.33%）明显高于食管癌细胞（45.36%），与Kuo等［5］的实验结果一致，说明P27kip1蛋白的表达活性降低可促进食管上皮细胞的恶性增值. 此外，在淋巴结转移阴性组的食管癌组织中，P27kip1蛋白的阳性率（55.36%）明显高于淋巴结转移阳性的食管癌组织中的阳性率（31.71%），高分化组中P27kip1蛋白的阳性率也显著高于中、低分化组，但与各年龄、临床分期、性别和瘤体大小无关. 该结果与Catzovelos等［6］报道的一致，提示P27kip1表达下降与食管癌的转移及侵袭能力有关. 因此，临床上可通过检测P27kip1蛋白的表达，预测正常食管上皮癌变的风险、评判食管癌的恶性程度和患者的预后状况.
　　本组资料表明，Skp2在30例癌旁食管组织阴性表达与食管癌中48.45%的阳性率比较差异有统计学意义（P&<0.01），说明Skp2与食管癌的恶性进程关系密切. Dowen等［7］在研究42例浸润型宫颈癌标本时发现，Skp2表达在高分化标本中呈低水平，随分化程度降低而表达增高. Hershko等［8］也检测到Skp2在分化良好的结肠直肠癌标本中几乎缺如，随分化程度的降低其表达逐渐增高. 本文的结论与此一致. 此外， Skp2在淋巴结转移组的阳性率明显高于无淋巴结转移组， 而与患病年龄、 性别、 临床分期及肿瘤大小无相关性. 因此， 检测Skp2也有助于预测食道上皮增殖、 癌变的发展趋势及瘤体分化程度的高低.

　　Nagner等［9］在对衰老的纤维母细胞研究中发现，Skp2减少p27kip1则相对增多，细胞则被阻止在G1期，而不能进入S合成期. Kudo等［10］小组用免疫组化法检测37例口腔上皮鳞状细胞癌标本的Skp2表达，18口腔上皮鳞状细胞癌Skp2表达增高，伴p27kip1低表达. 本文的研究结果与上述报道相似，两变量间具有交互作用. 说明Skp2和p27kip1二者在肿瘤发生、发展中关系密切，若Skp2与p27kip1同时出现异常表达，Skp2表达增高，p27kip1表达降低，且二者呈负相关联时，该肿瘤细胞增殖旺盛、恶性程度高，淋巴结转移的可能性大，预后也较差. 此外，针对Skp2和p27kip1的作用机制，采用抑制Skp2表达和/或p27kip1的降解，可作为一个新的基因治疗的作用靶点.

参考文献

　　［1］Polyak K， Kato JY， Solomon MJ， et al. p27kip1， a cyclinCDK inhibitor: Links transforming growth factorβ and contact inhibition to cell cycle arrest［J］. Genes Dev， 1994， 8（1）: 9-22.

　　［2］Nakayama KI， Hatakeyama S， Nakayama K. Regulation of the cell cycle at the G1S transition by proteolysis of cyclinE and p27kip1［J］. Biochem Bilphys Res Commun， 2001， 282（4）: 853-860.

　　［3］Hengst L， Reed SI. Translation contral of p27kip1 accumulation during the cell cycle［J］. Science， 1996， 271（5257）: 1861-1864.

　　［4］Pagano M， Tam SW， Theodoras AM， et al. Role of the ubiquitinproteasome pathway in regulating abunlance of the cyclindependent kinase inhibitor P27［J］. Science， 1995， 269（5224）: 682-685.

　　［5］Kuo MY， Hsu HY， Kok SH， et al. Prognostic role of p27 (kip1) expression in oral squsmous cell carcinoma in Taiwan［J］. Oral Oncol， 2002， 38(2): 172-178.

　　［6］Catzavelos C， Bhattabharya N， Ung YC， et al. Decreased levels of the cellcycle inhibitor P27kip1 protein: Prognostic implications in primary breast cancer［J］. Nat Med， 1997， 3(2): 227-230.

　　［7］Dowen SE， Scott A， Mukherjee G， et al. Overexpression of Skp2 in carcinoma of the cervix does not correlate inversely with p27 expression［J］. Int J Cancer， 2003， 105(3): 326-330.

　　［8］Hershko D， Bornstein G， Ben Izhak O， et al. Inverse relation between levels of p27(Kip1) and of its ubiquitin ligase subunit Skp2 in colorectal carcinomas［J］. Cancer， 2001，91（9）:1745-1751.

　　［9］Wagner M， Hampel B， Hutter E， et al. Metabolic stabilization of p27 in senescent fibroblasts correlates with reduced expression of the Fbox protein Skp2［J］. Exp Gerontol， 2001， 37（1）: 41-45.

　　［10］Kudo Y， Kitajima S， Sato S， et al. High expression of S2 phase kinase interacting protein 2， human F2 boxprotein， correlates with poor prognosis inoralsquamous cell carcinomas［J］. Cancer Res， 2001， 61（19）:7044-7047.