关于环氧化酶2抑制剂预防大鼠化学性乳腺癌

【摘要】 目的： 观察环氧化酶2 (COX2)选择性抑制剂塞来昔布对化学致癌剂7，12二甲基苯蒽（DMBA）化学诱发的大鼠乳腺癌形成的影响. 方法： DMBA油剂灌胃复制大鼠乳腺癌模型，90只大鼠分为3组，单纯诱癌组作为阴性对照、三苯氧胺组作为阳性对照、观察塞来昔布对大鼠乳腺肿瘤发生率和bcl2， VEGF蛋白表达的影响. 结果： 三苯氧胺组（48.2%）和塞来西布组（50.0%）肿瘤发生率低于单纯诱癌组（85.7%，分别为P=0.003，P=0.004）. 塞来昔布组VEGF蛋白表达率（42.9%）低于单纯诱癌组（79.2%，P=0.023），和三苯氧胺组（46.2%）无差异（P=0.863）. 塞来昔布组bcl2蛋白表达率（42.9%）低于单纯诱癌组（83.3%，P=0.010），低于三苯氧胺组（53.9%），但无差异（P=0.568）. 结论： 塞来昔布能抑制DMBA诱发的大鼠乳腺癌的发生、发展，下调bcl2和VEGF蛋白表达可能是其机制之一.
【关键词】 乳腺肿瘤 化学预防 三苯氧胺 塞来昔布 环氧化酶2
　　0引言
　　环氧化酶(cyclooxygenase，COX)参与维持机体各种生理和病理过程. COX1是一种结构酶，它催化产生的PG参与机体正常生理过程和保护功能，COX2被认为是诱导型酶，只在病理情况下才表达，包括炎症、损伤、修复及肿瘤的生长和转移. 许多癌前病变和恶性肿瘤均有COX2基因扩增和蛋白的高表达，有效抑制COX2的表达可能对肿瘤发生、发展具有重要意义［1-2］. 本研究在用化学致癌剂7，12二甲基苯蒽(7，12dimethylbenz anthracene，DMBA)诱发大鼠乳腺癌的过程中，观察COX2特异性抑制剂塞来昔布对DMBA化学诱发的乳腺癌形成及bcl2及VEGF蛋白表达的影响.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　实验用未交配雌性SD大鼠90只，鼠龄（45±5）d，体质量（110±10）g，以DMBA油剂200 mg/kg灌胃复制大鼠乳腺癌模型. 每组30只大鼠，分为单纯诱癌组（造模后正常饮食）作为阴性对照、三苯氧胺组（饮用水加入4 mg /kg三苯氧胺，正常饮用）作为阳性对照、塞来昔布组（饲料加入1000 mg/kg塞来昔布，用玉米油溶解后，拌于正常饲料内喂养）. 观察各组大鼠进食、毛发、排泄情况，并每周两次检测大鼠乳腺.
　　1.2方法
　　于实验的第120日停药，经阴道涂片检查，证实为间情期，以50 g/L乌拉坦液腹腔注射麻醉，将每个乳腺连同周围皮肤、皮下组织解剖，自乳头部对半切开乳腺进行大体观测，计数肿瘤数量及形态，标本固定于40 g/L甲醛溶液中，常规石蜡包埋，HE染色. 乳腺癌诊断参考实验性大鼠乳腺癌分类诊断标准［3］.
　　免疫组化SP法检测bcl2和VEGF蛋白表达： 4 μm石蜡切片，二甲苯常规脱蜡，梯度酒精水化，30 g/L h3O2甲醇室温下封闭，微波炉修复抗原，非免疫性羊血清以阻断组织中非特异性吸附，滴加兔抗鼠bcl2，VEGF多克隆抗体(1∶100)，湿盒内4℃冰箱过夜，滴加生物素标记的二抗 IgG，滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片. 以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，阳性判定标准：无阳性染色；＋，弥散弱的胞浆染色， 染色细胞数＜10％； ，中等至强的胞浆染色， 阳性细胞数介于10％～50％；，50％以上的细胞强染色.
　　统计学处理： 统计学检验采用SPSS 10.0软件进行， P&<0.05为有显著性差异.
　　2结果
　　实验结束前死亡大鼠未纳入实验结果统计，实验结束时每组有完整数据的大鼠数为：单纯诱癌组28只，三苯氧胺组27只，塞来昔布组28只.
　　2.1单纯诱癌组、三苯氧胺组和塞来昔布组乳腺癌发生率
　　单纯诱癌组24只大鼠发生乳腺癌，发生率为85.7％（24/28）；三苯氧胺组13只大鼠发生乳腺癌，发生率48.2%（13/27）；塞来昔布组14只大鼠发生乳腺癌，发生率50.0％（14/28）；三苯氧胺组、塞来昔布组乳腺癌发生率低于单纯诱癌组(χ2＝8.811， P=0.003；χ2＝8.187， P=0.004)；三苯氧胺组与塞来昔布组的乳腺癌发生率无显著性差异(χ2＝0.019， P=0.891).
　　2.2VEGF蛋白在乳腺癌组织中的表达
　　VEGF蛋白的阳性染色颗粒位于乳腺癌细胞的胞浆内，部分内皮细胞可见阳性着色，塞来昔布组（图1A）与单纯诱癌组（图1B）比较，VEGF蛋白的表达明显减弱. VEGF蛋白在3组肿瘤组织中的表达为，3组之间阳性表达率差异有统计学意义(χ2=6.457，P=0.040)；塞来昔布组VEGF蛋白阳性表达率低于单纯诱癌组，差异有统计学意义（χ2=5.179，P=0.023）；塞来昔布组VEGF蛋白阳性表达率与三苯氧胺组无统计学差异（χ2=0.030，P=0.863）. 三苯氧胺组和单纯诱癌组VEGF蛋白阳性表达率有统计学差异（χ2=4.194，P=0.041，表1）.表1VEGF和bcl2蛋白在单纯诱癌组、三苯氧胺组、塞来昔布组乳腺癌组织中的表达(略)
　　2.3bcl2蛋白在乳腺癌组织中的表达
　　bcl2蛋白的阳性染色颗粒位于乳腺癌细胞的胞浆内，部分内皮细胞可见阳性着色，塞来昔布组（图2A）与单纯诱癌组（图2B）比较，bcl2蛋白的表达明显减弱. bcl2蛋白在3组肿瘤组织中的表达为，塞来昔布组bcl2蛋白阳性表达率低于单纯诱癌组，差异有统计学意义（χ2=6.705，P=0.010）；塞来昔布组bcl2蛋白阳性表达率与三苯氧胺组无统计学差异 （χ2=0.326， P=0.568）； 三苯氧胺组bcl2蛋白阳性表达率低于单纯诱癌组， 但无统计学差异（χ2=3.718， P=0.054， 表1）.
　　3讨论 　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，三苯氧胺是乳腺癌预防和治疗的一线用药和金标准. 许多癌前病变和恶性肿瘤中均有COX2基因的扩增和蛋白的高表达，有效抑制COX2的表达对预防肿瘤发生发展有重要意义. 本研究采用三苯氧胺作为阳性对照，在大鼠化学性乳腺癌的发生过程中，观察塞来昔布对大鼠乳腺癌形成的影响，并探讨其抗肿瘤形成的机制.
　　本研究发现，塞来昔布组乳腺肿瘤发生率明显低于单纯诱癌组，表明塞来昔布能有效抑制DMBA诱发的大鼠化学性乳腺癌的发生、发展，对乳腺癌高危人群预防具有潜在的应用价值. 其他学者也有类似报道， Harris等［4］用塞来昔布处理DMBA诱导的乳腺癌模型，发现塞来昔布能明显延迟肿瘤的发生，与优布芬相比更加有效. 饲料内混入塞来昔布乳腺癌的发生率，多发率及肿瘤体积，较对照组低.
　　COX2参与肿瘤的发生发展的机制尚不完全清楚，可能包括：刺激增殖、抑制凋亡、抑制免疫机能、参与前致癌物的代谢等途径. COX2 过度表达可剌激肿瘤新生血管的形成，但其机制尚未完全明确，其直接产物PGE2能直接刺激血管生成；同时， PGE2能诱导组织生成VEGF，产生的VEGF以旁分泌和自分泌的形式作用于内皮细胞，从而促进血管形成. 本研究发现，在塞来昔布处理的肿瘤组织中，VEGF蛋白的表达水平明显低于单纯诱癌组，表明作为VEGF的上调因子，抑制COX2的表达和活性可明显下调VEGF的表达，两者具有明显的相关性. 人结肠癌细胞株转染COX2 基因发现肿瘤细胞在过度表达COX2 的同时促血管生成因子VEGF， bFGF， PDGF， 内皮素等均明显上调，并促进人脐静脉内皮细胞株增殖并形成网状的内皮细胞条索［5］. Chang等［6］的研究也认为COX2诱导的乳腺癌发生发展和PGE2依赖的的肿瘤新血管生成关系密切. 谯敏等［7］发现以COX2为靶向的RNA干扰显著抑制胃癌细胞生长，可能与下调COX2基因表达和诱导细胞凋亡有关，这些均说明COX2能刺激肿瘤新血管生成，而下调VEGF表达是特异性COX2抑制剂塞来昔布的抗肿瘤机制之一.
　　Celecoxib 抑制细胞凋亡的机制还不完全清楚，包括增加bcl2表达、减弱NO信号途径和阻断AKT磷酸化等途径. bcl2是主要的抗凋亡和抗氧化蛋白，COX2可上调bcl2蛋白表达，同时下调凋亡蛋白bax和bclXL的表达［8］. 本研究发现塞来昔布处理后的肿瘤组织细胞的bcl2表达在蛋白水平上明显低于对照组，差异具有显著性，表明通过下调bcl2的表达、诱导凋亡产生是塞来昔布的抗肿瘤机制之一.
　　我们的研究表明，选择性COX2抑制剂塞来昔布可以有效预防大鼠乳腺癌的发生，机制可能与下调VEGF和bcl2蛋白表达有关.

参考文献

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