关于结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

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【摘要】 目的: 构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒，并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌Ｈ37Ｒｖ中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆ｐGEX4T1中，构建重组表达质粒ｐGEX4T1Rv3873并转化E.coli JM109，异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化，SDSPAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX4T1Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白，占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX4T1Rv3873，并在大肠杆菌得到表达.
【关键词】 结核分枝杆菌 RD1区；PPE68/GST融合蛋白 表达
　　0引言
　　世界卫生组织的最新研究报告指出，由于艾滋病蔓延及结核杆菌耐药菌株的产生，使结核病的流行日益盛行.结核病的快速准确诊断，是全球控制结核病的重要措施.Rv3873编码的PPE68蛋白是结核分枝杆菌(MTB)PPE蛋白家族的一员，它可能与结核分枝杆菌抗原变异和逃避免疫机制有关，具有重要的免疫学意义，是一种免疫优势抗原［1］.我们克隆表达并纯化PPE68蛋白，以期待进一步研究其免疫特性，评价其是否可作为结核诊断试剂的候选蛋白.
　　1材料和方法
　　1．1材料
　　结核分支杆菌标准株H37Rv由四川省疾病预防控制中心结核病预防控制所提供；结核患者血清抗体由绵阳市疾病预防控制中心所提供;Ｅ.coli JM109，质粒pGEX4T1由本室保存. pfu DNA聚合酶， dNTP，核酸相对分子量标准DL2000，Marker VI均购于天为时代有限公司；限制性内切酶BamHI，EcoRI，蛋白质分子质量标准均购于晶美公司; T4 DNA连接酶购于上海生工生物工程有限公司;质粒微量抽提试剂盒、硝酸纤维膜素滤膜、DAB试剂盒购于西安宝信生物有限公司；胶回收试剂盒、EB（溴化乙锭），琼脂糖、DAB试剂盒、溶菌酶、丙烯酰胺、NN亚甲基双丙烯酰胺、SDS（十二烷基磺酸钠），二硫苏糖醇（DTT），异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）均购自成都溶海生物科技有限公司；GST融合蛋白纯化试剂盒购自上海杰美基因公司；辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG购自北京中山生物技术有限公司.其余试剂均为国产或进口分装分析纯级产品.
　　1.2方法
　　基因组DNA提取参照文献［2］的方法稍加修改后进行.根据GeneBank中Cole等［3］报道的结核杆菌H37Rv株Rv3873基因序列设计引物. 引物序列: P1: 5′ATA GGA TCC ATC ACC ATG CTG TGG CAC3′; P2: 5′TAT GAA TTC CAT TAC GGG AGC TCA CCA GT3′. 引物P1及P2的5′末端分别引入BamHI和EcoRI酶切位点(用下划线表示).
　　上述引物由上海生工生物工程有限公司合成.Rv3873基因的PCR扩增以结核分支杆菌H37Rv基因组DNA为模板，反应条件为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min;59℃复性1 min;72℃延伸2 min;72℃ 5 min共30个循环;72℃继续延伸5 min.反应结束后取5UL扩增产物于8 g/L琼脂糖凝胶中电泳检测结果.将PCR产物及载体pGEX4T1用限制性内切酶BamHI和 EcoRI分别进行双酶切后用胶回收试剂盒回收.用T4 DNA连接酶将回收后的目的片段与载体在16℃连接过夜.取连接反应物5 UL转化感受态大肠杆菌（氯化钙法制备［4］）JM109，取转化菌液200 UL涂布于含氨苄青霉素（50 mg/L）的LB固体培养基上，37℃培养过夜.随机挑取阳性转化子培养并提取质粒DNA进行酶切及PCR鉴定.将鉴定含有目的基因的重组质粒保种菌液送至宝生物工程有限公司进行测序.挑取含有重组质粒的JM109单菌落37℃振摇培养过夜，以1∶100转种于含有氨苄青霉素(50 mg/L)的LB液体培养基中，继续振荡培养至OD600为0.6时，加入IPTG至终浓度1 mmol／L，诱导表达4 h. 同时用JM109菌和含空载体pGEX4T1的JM109菌作对照. 取菌液1 mL离心，PBS洗涤3次后用PBS重悬菌体，加入溶菌酶（10 g/L）至终浓度为10 mg/L，室温放置30 min，反复冻融，12 000 r/min离心5 min分别取上清和沉淀加入1×SDS上样缓冲液，煮沸5 min后，进行SDSPAGE.大量诱导表达蛋白，方法同前，处理菌体分为上清和沉淀，每克沉淀重悬于2 mL含8 mol/L尿素的0.1 mol/L TrisCl (pH 8.5)中，室温静置30 min，离心，转移上清，以透析法除去蛋白样品中尿素，透析后的样品于-20℃保存［4］.按照GST亲和层析柱所提供的方法纯化融合蛋白.将上述纯化产物和JM109对照菌表达产物进行SDSPAGE后转移至硝酸纤维素膜上，50 ｇ/Ｌ脱脂奶粉4℃封闭过夜，加入结核患者血清（1∶100）， 37℃孵育过夜， TTBS洗涤3次， 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG (1∶500)， 37℃孵育1 h， TTBS洗涤3次， DAB试剂显色.
　　2结果
　　2.1重组质粒pGEX4T1Rv3873的鉴定
　　用ＰＣＲ方法以ＭＴＢＨ37Ｒｖ基因组DNA为模板进行扩增，经8 g/L琼脂糖凝胶电泳后，得到约为1125 bp的DNA条带，与预计目的基因片段大小相符，而空白对照未扩增出条带（图1）分别用EcoRI和BamHI对重组质粒pGEX4T1Rv3873进行单酶切，均见一约3775 bp片段，比空质粒双酶切约大1125 bp;用BamHI和EcoRI对重组质粒pGEX4T1Rv3873进行双酶切，见与空质粒和PCR产物等大约4900 bp和1125 bp两个片段；对酶切正确的重组质粒进行PCR扩增鉴定，扩增出约为1125 bp的目的片段（图2）.重组质粒经测序，结果显示，重组质粒所含目的基因片段与GenBank中报道的结核分支杆菌H37Rv株Rv3873基因序列同源性为100%，表明pGEX4T1Rv3873重组质粒构建成功.

　　2.2融合蛋白表达和纯化含重组表达
　　质粒pGEX4T1Rv3873的E.coli JM109经IPTG诱导后，能够表达1条约为Mr 63 000的融合蛋白条带，其中PPE68约为Mr 37 330， GST约为Mr 27 000，凝胶扫描分析融合蛋白占菌体总蛋白的40％.该蛋白存在于裂解菌体的沉淀中，说明该蛋白主要以不可溶的包涵体形式表达.空菌和空载体组未见此蛋白条带.纯化后的蛋白经薄层扫描分析融合蛋白纯度可达85%以上（图3）.纯化蛋白在约Mr 63 000处出现明显杂交信号，而JM109对照菌在该处未出现杂交信号（图4）.
　　3讨论
　　找到结核分支杆菌的特异性抗原，对于结核病的诊断及开发新疫苗均具有重要意义.RD1区是BCG减毒传代过程中最先缺失的一段区域，它与结核分枝杆菌毒力相关，因为该区基因所编码的蛋白能被宿主免疫系统高度识别，目前大家对结核分枝杆菌诊断试剂的研究主要集中在RD1区，RD1区一共编码9个蛋白，PPE68是由位于该区的Rv3873所编码［5］.研究表明PPE68能够被T淋巴细胞所识别，激发出强烈的细胞免疫，刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，诱导大量IFNγ产生，可以认为PPE68是除esat6和cfp10以外的第3种重要的免疫优势抗原.由于编码Rv3873，cfp10，esat6的3个基因相邻， 有学者称， 这3个基因形成的基因簇在结核分枝杆菌中编码了的一个新的传输系统，这个新的功能单位与宿主免疫系统间有着紧密的联系，这种功能单位不仅仅存在于RD1区，同时也存在于其他跟PPE蛋白家族相毗邻的类esat6和cfp10蛋白的基因簇［6］.
　　我们通过设计MTB Rv3873特异性引物，用ＰＣＲ方法从ＭＴＢＨ37ＲvＤＮＡ库中扩增出目的基因Rv3873，序列测定与Genbank完全一致.为使融合基因得到高效及稳定的表达以及考虑到纯化工作，我们选择了pGEX4T1作为表达GST融合蛋白的原核高效表达载体，它带有强的tac启动子，构建的表达载体中，SD序列下游是GST基因，目的基因接在GST下游，因此表达产物为带有GST的融合蛋白即PPE68／GST.这种表达系统可以克服转录和转录后水平对外源基因表达可能带来的不利影响，表达的PPE68／GST融合蛋白便于通过GST亲和层析纯化，从而获得了纯化的PPE68，用结核患者血清进行Western Blot试验，证实所获得的融合蛋白PPE68/GST可以与患者血清发生反应，提示PPE68可作为结核病诊断用特异性抗原，为进一步研究它在血清诊断中的作用奠定了基础.

参考文献

　　［1］Voskuil MI，Schnappinger D， Rutherford R，et al. Regulation of the mycobacterium tuberculosis［J］. Tuberculosis，2004，84:256-262.

　　［2］Whipple DL，leFebver RB，Andrews RE Jr，et al.Isolation and analysis of restriction endonucleas disgestive patterns of chromosomal DNA from mycobacterium paratuberculosis and other mycobacterium species［J］.J Clin Microbiol，1987，25:1511-1515.

　　［3］Cole ST，Brosch R，Parkhill J，et al.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence［J］.Nature，1998，393:537-544.

　　［4］黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南［M］. 3版.北京:科学出版社，2002:96-99，1256-1259.

　　［5］Behr M，Wilson M，Gill W， et al. Comparative genomics of BCG vaccines by wholegenome DNA microarray［J］. Science， 1999，284:1520-1523.

　　［6］Okkels L，Brock I，Follmamnn F，el al.PPE protein (Rv3873) from DNA segment RD1 of Mycobacterium tuberculosis: strong recognition of both specific Tcell eptiopes and epitopes conserved within the PPE family［J］. Infect Immum，2003，71:6116-6123.