关于无泵驱动体外膜肺治疗急性呼吸衰竭犬肺组织内皮素1前体原mRNA的表达

【摘要】 目的: 观察双侧股动脉股静脉无泵驱动体外膜肺（bAVECMO）治疗急性呼吸衰竭犬肺组织内皮素1前体原和内皮素1（ET1）的表达. 方法: 10只犬在建立急性呼吸衰竭模型情况下给予bAVECMO治疗. 分别于模型建立完成时、转流开始后1，2，3，4 h取肺组织. 应用放免及RTPCR技术，观测bAVECMO期间肺组织匀浆ET1变化、肺组织ppET1 mRNA的转录表达变化. 结果：犬ARDS模型肺组织匀浆ET1含量转流2 h达到高值，之后缓慢下降. 方差分析表明肺组织匀浆ET1的均数在转流前后差异有统计学意义. 肺组织匀浆ET1转流3 h与4 h差异无统计学意义. RTPCR对ppET1 mRNA的结果与肺组织匀浆ET1放免结果相一致. 结论：对于急性呼吸衰竭bAVECMO的早期治疗有积极意义.
【关键词】 急性呼吸衰竭 内皮素1 动脉静脉无泵驱动体外膜肺氧合
　　0引言
　　近年来研究发现急性呼吸衰竭(ARF)和急性呼吸窘迫综合症(ARDS)时内皮素1 mRNA表达显著增强，说明ET1参与了急性肺损伤的病理生理过程. 在对ARF、ARDS的治疗中无泵驱动体外膜肺辅助(AV)转流技术(AVECMO)由于其有效并对血液有形成份破坏轻等优点，已被应用于临床［1］. 在应用AVECMO转流中，国外均采用单侧股动脉股静脉ECMO转流，在临床中表现了一定的不足，如引流量不够大，影响了AVECMO的效果；但如应用大口径动脉插管来增加动脉引流，则会严重影响插管侧下肢血液供应等. 本项研究首次采用双侧股动脉股静脉无泵驱动体外膜肺（bAVECMO）转流技术，通过治疗犬急性呼吸衰竭模型，观察肺组织ppET1 mRNA，ET1的变化，为临床提供参考依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　选择健康成年家犬10只，雌雄不限，体质量18~35（23.4±4.7) kg，用35 g/L苯巴比妥100 mg/kg腹腔注射麻醉，待犬意识不清时，气管插管与麻醉机连接. 常规消毒铺巾，分别解剖犬左、右两侧的股动脉及股静脉，全身肝素化，用量为1 mg/kg，股动脉，股静脉上、下两端分别套丝线，结扎下端的股动脉、股静脉. 阻断股动脉、股静脉上端，再阻断与结扎血管的中下端，切开血管. 根据动、静脉内径的大小选择不同型号的PVC动、静脉插管，插管后结扎固定以防止脱出，常规缝合皮下、皮肤，防止伤口渗血. 将动、静脉插管与bAVECMO装置连接. 右侧胸部开胸沿着第4肋间进胸，切开心包分别将心包固定在切口边缘，主动脉根部置入测压针管及测压装置，将此装置与飞利浦有创血压、心率动态监护仪连接. 当bAVECMO转流时，通过bAVECMO端口应用1000 mL/L氧气，其用量为(1.2±0.4) L/min. 建立循环后，根据不同的转流时间收集标本. ①在体外循环开始前，经胸部切口取右肺下叶少许组织（10 mm×10 mm），置液氮罐待检测. ②制作呼吸衰竭动物模型进行试验. 应用潘克罗宁（Pancuronrum，0.1～0.2 mg/kg），首次剂量为4 mg，以后每30 min左右追加2 mg使呼吸完全消失. 通过麻醉机调节呼吸频率和潮气量（犬在安静状态下潮气量如体质量在16.4～30.5 kg，潮气量多在251～432 mL）. 采用血气分析仪测定犬动脉血pH值、动脉血氧分压、动脉血氧饱和度及动脉血二氧化碳分压值，当达到呼吸衰竭指标时，经右心房抽血10 mL于注射器内，立即密封置冰盒待检. 另经胸部切口取右肺下叶少许组织（10 mm×10 mm），置冰盒后待检测. 开始bAVECMO转流实验后1， 2， 3， 4 h，分别经右心房抽血10 mL、胸部切口取右肺下叶少许组织（10 mm×10 mm），置液氮罐待检测.
　　1.2方法
　　1.2.1肺组织匀浆ET1含量测定
　　采用SN 695型全自动γ计数器(上海原子核所，放射免疫药盒购自解放军总医院科技开发中心放免所)，以放射免疫法测定标本ET1含量.
　　1.2.2肺组织ppET1检测
　　采用RTPCR法，步骤如下：采用Trizol一步法提取研磨肺组织总RNA并测定其浓度和纯度. 从GenBank下载内皮素1前体原(preproET1)的基因序列（NM001002 956），使用PPrimer 5.0软件分析设计引物（TaKaRa公司合成）. preproET1的一对引物为：sense: 5′ATGGACCACTTGGAAAGCAG3′; antisense: 5′GGCACCTGAGTGAGACACAA3′，PCR产物长度135 bp. 以βactin为内参照: sense: 5′CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC3′; antisense: 5′AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC3′，PCR产物长度：587 bp. RTPCR条件：采用TaKaRa公司One Step RNA PCR Kit（AMV）试剂盒. 每个反应加总RNA 0.75 μg，上、下游引物各20 pmol，逆转录酶、Taq酶、RNasin、dNTP及Buffer均按照试剂说明加样. 50℃逆转录30 min，94℃变性2 min，继以PCR扩增. 扩增条件如下:变性94℃，30 ｓ；退火55℃，30 ｓ；延伸72℃，1.5 min. 共35个循环. RTPCR产物以20 ｇ/Ｌ琼脂糖电泳，以目的基因cDNA与βactincDNA量的比值表示目的基因mRNA表达的相对强度.
　　统计学处理： 数据以x±s表示，用SPSS 10.0统计软件进行重复测量资料的方差分析. P&<0.05有统计学意义.
　　2结果
　　2.1内皮素PPET1 mRNA表达犬急性呼吸衰竭模型肺组织内皮素PPET1 mRNA表达在应用bAVECMO早期治疗时有显著变化. 其PPET1 mRNA表达在模型建立完时上升经转流治疗2 h后无进一步上升，且有下降趋势，与肺组织匀浆放免结果（表1）相一致.
　　2.2肺组织内皮素变化肺组织匀浆ET1含量转流2 h达到高值，之后缓慢下降. 肺组织匀浆ET1的均数变化在转流过程中有统计学意义， 但转流3 h与4 h间无统计学差别(表1).表1肺组织匀浆ET1和ppET1 mRNA表达在转流期间变化(略)

　　3讨论
　　在对ARF，ARDS治疗技术探索中，ECMO是一项具有重要意义的治疗方法. 但传统的ECMO治疗有血细胞损伤致出血及栓塞等诸多缺点，这些都是由于ECMO治疗时血泵的使用引起的. bAVECMO避免了传统ECMO治疗方法的诸多缺点，对呼吸衰竭动物模型肺组织内皮素1前体原的研究对其应用推广具有意义.
　　内皮素（ET）是机体在缺氧、应激状态下产生的一种致损伤因子. 人体存在4种内皮素（ET1，ET2，ET3，VIC），研究认为［2］ET1是缺氧致肺血管收缩的支撑因素，而肺是ET1的主要生物合成和代谢场所. 影响ET1释放的因素均是直接、间接的通过影响ppET1 mRNA在肺部的转录和翻译而引起ET1的释放. 在我们建立了呼吸衰竭模型条件下，缺氧快速而敏感地促进包括缺氧诱导因子1(HIF1)在内的细胞因子对缺氧反应基因加以调控， 通过与肺血管内皮细胞中作为目标基因的ET1基因结合位点结合，激活ET1基因，经剪切后合成为内皮素前体原1 mRNA（ppET1 mRNA），其在胞浆中粗面内质网内翻译合成为内皮素前体原1（ppET1），而再水解分裂为内皮素1前体(pET1)，pET1的生物活性只有转换成ET1才发挥其生理效应，而ET1降解的时相却极短（仅1~2 min就有60%以上的ET1被清除， 且不伴有相应降解产物的出现）. 由于其降解过程短暂，需要ppET1 mRNA表达的增加维持肺组织中ET1的含量较长时间的升高. 这表明肺组织中ET1的含量升高是由于缺氧致ET1基因启动，使ppET1 mRNA的翻录、合成增加所致，且其含量的维持需缺氧诱导ppET1 mRNA的表达持续. 在bAVECMO的早期转流逐步改善了缺氧及二氧化碳储留后，肺组织中促使ppET1 mRNA表达的因素减少，ppET1 mRNA表达呈下降趋势，肺组织匀浆中ET1测定水平降低与生成减少相关联，这与我们RTPCR对ppET1 mRNA的定量分析相一致也与放免试验对肺组织匀浆ET1含量测定结果相一致，但与部分研究中ET1水平在经治疗后短期仍升高较晚才出现下降不一致［3-4］，对此我们认为在本研究中ppET1 mRNA在肺脏中的表达早期即有下降趋势而使肺组织ET1水平下降可能与bAVECMO的早期应用相关，在细胞未产生不可逆损伤前，单纯消除缺氧诱导因素后ppET1 mRNA表达即减少，同时使ET1释放相应减少. 因此，我们认为对于急性呼吸衰竭而言，bAVECMO早期应用以便对缺氧诱导ppET1 mRNA表达因素早期消除，对患者预后应有积极意义.

【参考文献】
　　［1］Liebold A， Rang CM， Philippi A， et al. Pumpless extracorporeal lung assist experience with the first 20 cases［J］. Eur J Cardiothoracic Surg， 2000， 17:608-613.

　　［2］Takeda S， Nakanishi K， Inoue T. Delayed elevation of plasma endothelin1 during unilateral alveolar hypoxia without systemic hypoxemia in humans［J］. Acta Anaesthesiol Scand， 1997， 41(2): 274-280.

　　［3］Lukaszewicz AC， Mebazaa A. Lack of alteration of endogenous nitric oxide pathway during prolonged nitric oxide inhalation in intensive care unit patients［J］. Crit Care Med， 2005，33(5):1008-1014.

　　［4］Macdonald PD， Paton RD. Endothelin1 levels in infants with pulmonary hypertension receiving extracorporeal membrane oxygenation［J］. J Perinat Med， 1999， 27(3): 216-220.