作者：胡沛臻 路凡 王孝功 李侠 司少艳 黄杨 马斌 张秀敏 隋延仿
【关键词】 黑色素瘤抗原；发酵；大肠杆菌
【Abstract】 AIM: To realize high celldensity fermentation of MAGE3/HSP70 engineered E.coli，and to evaluate the antitumor immunity of MAGE3/HSP70 fusion protein in vivo. METHODS: High celldensity fermentation of MAGE3/HSP70 enginered E. coli was carried out with constant soluble oxygen and continuous cultivation in selfcontrol fermentor. The mouse was immunized by purified MAGE3/HSP70 fusion protein in E.coli， and the antitumor immunity was detected by ELISPOT and LDH release assay. RESULTS: High celldensity fermentation of MAGE3/HSP70 engineered E.coli was successful， and the expression of MAGE3/HSP70 in fermented bacterial was the same as the flask culture. The results of ELISPOT and LDH release assay showed that MAGE3/HSP70 generated tumor specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) to damage tumor cel1. CONCLUSION: High celldensity fermentation of MAGE3/HSP70 engineered E.coli was realized and MAGE3/HSP70 fusion protein can generate specific CTL to kill tumor cel1.
【Keywords】 Melanoma antigen; fermentation; E.coli
【摘要】 目的：实现重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌的高密度发酵，并测定MAGE3/HSP70融合蛋白在体内的抗肿瘤免疫效应. 方法：利用自控发酵罐发酵，采用溶氧反馈，分批补料的方法对MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌进行了高密度发酵，从菌体中纯化MAGE3/HSP70融合蛋白，并用所纯化的MAGE3/HSP70融合蛋白免疫小鼠，运用酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞毒性杀伤实验(LDH)检测了融合蛋白激活机体细胞免疫反应的状况. 结果：高密度发酵取得成功，发酵菌中MAGE3/HSP70融合蛋白的表达量与摇瓶中的相当，摸索出发酵水平纯化MAGE3/HSP70融合蛋白工艺，ELISPOT和LDH显示MAGE3/HSP70可以激活机体免疫反应，并产生针对MAGE3的CTL，特异性杀伤表达MAGE3的肿瘤细胞. 结论：MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌成功实现高密度发酵，MAGE3/HSP70融合蛋白可以有效激活机体免疫反应，产生针对特异性抗原MAGE3的CTL，免疫学活性良好，为新型抗肿瘤疫苗临床前研究奠定了良好基础.
【关键词】 黑色素瘤抗原；发酵；大肠杆菌
0引言
黑色素瘤抗原（melanoma antigenassosiated gene，MAGE）是第一类被发现的肿瘤排斥抗原［1-2］，MAGE3是MAGE家族成员之一，不仅在黑色素瘤表达，同时在其它多种肿瘤中均有不同程度的表达，能够诱导机体特异性的CTL反应，更重要的是在除睾丸和胎盘外的正常组织中均不表达，人们认为它是肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子之一［3-4］. 重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白(专利申请号：ZL03134626.X)是我室研制和开发的一种新型肿瘤疫苗［5］，它对肝癌、胃癌、乳腺癌等常见恶性肿瘤具有良好的治疗效果和预防效果，在肿瘤的治疗方面具有潜在的临床应用价值［6］. 本研究目的是实现重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌的高密度发酵，并用从发酵菌中纯化的目的蛋白，测定其在体内的抗肿瘤免疫效应，为通过动物肿瘤模型研究MAGE3/HSP70融合蛋白在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础.
1材料和方法
1.1材料含MAGE3/HSP70基因的重组表达质粒pET28a／MAGE3HSP70由本室构建，宿主菌BL21（DE3）本室保存. NBS Bioflo Ⅳ20L自动发酵罐(NBS公司)；J6B型大容量冷冻离心机(Beckman公司)；微量蛋白电泳仪(BioRad公司)；KTA explorer 100层析系统(Amersham Pharmacia Biotech公司);实验动物是由第四军医大学实验动物中心引进繁殖的4～6 wk龄二级C57BL/6小鼠40只，体质量18～20 g，均为雌性，在SPF级饲养条件下进行试验. 转MAGE3基因的小鼠黑色素瘤细胞B16MAGE3由本实验室马家海博士构建，MAGE3蛋白和HSP70蛋白由本实验室马家海博士提取并鉴定. 小鼠IFNγ ELISPOT系统(法国Diaclone公司); Cytotox96检测试剂盒(Promega公司); Ficoll淋巴细胞分离液(Sigma公司); 蛋白胨、酵母抽提物(Oxoid公司); SOURCE 30Q及Sephacryl S200HR (Pharmacia公司); IPTG (Sigma公司); 抗MAGE3多克隆抗体(R&&D公司);其余试剂均为国产分析纯试剂. 主要溶液的配制①种子液：1000 mL种子液中含蛋白胨16 g，酵母提取物10 g，甘油20 mL，NaCl 5 g，用5 mol／L NaOH将pH值调至7.0；②发酵液：每升发酵液中含有蛋白胨20 g，酵母抽提物9 g，甘油5 mL，十二水磷酸氢二钠6 g，磷酸二氢钾1.5 g，硫酸铵1.5 g，氯化铵1 g，七水合硫酸镁0.25 g，氯化钙0.02 g，硫酸亚铁0.04 g，甘氨酸0.5 g. 每升补料基质含有：甘油120 mL，蛋白胨80 g，酵母抽提物40 g，七水合硫酸镁5 g.
1.2方法
1.2.1种子培养取-70℃，100 g/L甘油保存的pETHM/BL21(DE3)菌种1支，从中挑取1环，划含卡那霉素(Kan)的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取一个边缘整齐、生长良好的单菌落接种到10 mL LB培养基中(含35 mg/L Kan)，37℃振荡培养12 h，以50 g/L接种量转接1次，37℃继续培养4 h左右，使其生长至对数生长期，以1%接种量转接至200 mL种子液中，37℃振荡培养过夜.
1.2.2发酵采用20 L NBS Bioflo IV自控发酵罐，发酵总体积12 L (0.6 L种子液，0.74 L发酵液，1.2 L缓冲液，9.48 L h3O)，含Kan (35 mg／L). 以AFSBioCommand Bioprocessing Software(Version 2.61)软件对其进行数据采集(每30 s采集数据1次)，实现计算机在线控制，全过程共10 h. 控制参数为：①空气流量设定为12 L/min，溶氧控制在40%，达到最大转速后，通入纯氧；②温度控制为37℃；③pH值设定为7.0，自动流加浓氨水以保持恒定；④搅拌速度：设定搅拌速度下限为200 r/mim，上限为1200 r/min. 生长过程中当溶氧低于设定值时通过计算机由AFSBioCom mand Bioprocessing Software(Version 2.61)软件控制每分钟增长5转. 诱导过后，搅拌速度改为由NBS Bioflo IV发酵罐自动溶氧反馈控制. ⑤补料流加：在生长阶段，当溶氧率在3 min内持续高于60％时补料泵以5％的速率进行补加营养. 诱导阶段当溶氧值在3 min内持续高于50％时补料泵以100％的速率进行补加营养1 min. 每1 h取样测定A600 nm值，当培养至A600 nm=12时IPTG诱导目的蛋白表达，诱导4 h后收集菌体，取小量进行SDSPAGE检测蛋白表达水平，其余菌体保存于-70℃用于纯化目的蛋白.
1.2.3目的蛋白的纯化4℃离心收菌，3 mL/g菌体重悬于Lysis Buffer（50 mmol／L Nah3PO4，300 mmol／L NaCl，10 mmol／L imidazole，pH 8.0)；加入溶菌酶至终浓度为10 g/L，冰浴30 min；超声裂解，功率2 kW，超声10 s，间隔10 s，共30 min；12 000 g，4℃离心15 min，取上清，0.45 μm针头滤器过滤；上NiNTA Superflow柱， Wash Buffer(50 mmol／L Nah3PO4， 300 mmol／L NaCl， 20 mmol／L imidazole， pH 8.0)冲洗后Elution Buffer(50 mmol／L Nah3PO4， 300 mmol／L NaCl， 250 mmol／L imidazole， pH 8.0)；洗脱，收集洗脱峰；SDSPAGE分析；以50倍体积的A液(20 mmol／L Tris・HCl， pH 8.0)透析24 h，中间换3次透析外液，透析后上清过用A液充分平衡的SOURCE 30Q柱，用B液(20 mmol／L Tris・HCl， 0.5 mol／L NaCl， pH 9.0)连续梯度洗脱4～5个柱床体积，收集洗脱峰，SDSPAGE分析；收集目的蛋白峰，以50倍体积的C液(20 mmol／L Tris・HCl， pH 7.4)透析24 h，中间换3次透析外液，透析后上清过用D液（137 mmol／L NaCl， 1.4 mmol／L Kh3PO4， 1.7 mmol／L KCl， 4.3 mmol／L Na2HPO4・12h3O，pH 7.4）液充分平衡的Sephacryl S200HR柱，收集洗脱峰；SDSPAGE及Western Blot鉴定. Bradford法测定蛋白的含量，冻干，-70℃保存.
1.2.4动物免疫和小鼠脾淋巴细胞的分离与活化C57BL/6小鼠30只，随机分为5组，每组6只，各组分别于第1，10，20日腹腔注射蛋白免疫，MAGE3组注射MAGE3蛋白3.2 μg（200 pmol）；HSP70组注射HSP70蛋白15.8 μg（200 pmol）；MAGE3/HSP70组注射融合蛋白18.6 μg（200 pmol）；HSP70＋MAGE3组注射HSP70蛋白7.9 μg（100 pmol）和MAGE3蛋白1.6 μg（100 pmol），对照组注射PBS，100 μL/(只・次). 末次免疫后10 d，小鼠球后动脉取血，断颈处死，无菌取脾脏，毛玻璃片轻轻捻碎脾脏，10号针头轻轻吹吸数次，用Ficoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞. 计数后，用AIMV培养液培养1 d后用于后续试验.
1.2.5MAGE3特异性T细胞的检测采用IFNγ ELISPOT方法： 依照法国DIACLONE公司ELISPOT检测试剂盒使用说明，用稀释好的捕获抗体（Capture Antibody）100 μL/孔包被PVDF板， 4℃静置16 h. 20 g/L脱脂乳PBS室温封闭2 h，加入PBS，MAGE3，HSP70，MAGE3/HSP70和MAGE3＋HSP70免疫小鼠得到的脾细胞细胞1×104个/孔，同时加入转MAGE3基因的小鼠黑色素瘤细胞B16MAGE3细胞5×104个/孔，每个实验组设置3个复孔，50 mL/L CO2纳胞培养箱静置培养20 h. 用PBS充分冲洗后加入检测抗体（Detection Antibody），于37℃孵育2 h，洗板，再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，同上孵育洗板，加入底物显色液. 避光显色20 min，1200 dpi扫描读取斑数，统计学分析.
1.2.6LDH释放法测定细胞杀伤效率方法参照文献［5］，主要步骤如下：以PBS，MAGE3，HSP70，MAGE3/HSP70和MAGE3＋HSP70免疫小鼠得到的脾细胞为效应细胞，以MAGE3基因的小鼠黑色素瘤细胞B16MAGE3细胞为靶细胞，以小鼠黑色素瘤细胞B16为对照，进行体外杀伤实验. 靶细胞浓度为1×104个/孔，效靶比分别为5∶1，10∶1和50∶1，37℃共育4 h，离心后，每孔吸取50 μL上清液进行LDH检测. 实验同时设立效应细胞自发释放孔，靶细胞自发释放孔，靶细胞最大释放孔和培养液背景孔. 每个实验组设3个复孔，用AIMV无血清培养液洗涤重悬细胞，所有检测孔所测得吸光度值减去培养液背景即为实际值. 按下公式计算：杀伤率=(实验组A-效应细胞自发A-靶细胞自发A)/ (靶细胞最大A-靶细胞自发A)×100％.
2结果
2.1工程菌的发酵为了获取足量的菌体进行研究，我们对工程菌进行了高密度发酵. 用溶氧反馈、分批补料的方法，采用20 L NBS Bioflo IV发酵罐进行高密度发酵. 接入种子液时菌体密度为A600 nm=0.01，6 h后达A600 nm=12.8. 200 μmoL/L IPTG诱导表达目的蛋白， 于诱导后4 h终止发酵， 发酵结束时A600 nm=48.2， 每升发酵液收湿菌70 g， 发酵曲线如图1.
图1pETMH/BL21(DE3)工程菌的发酵曲线（略）
2.2MAGE3/HSP70融合蛋白的表达及纯化结果显示，在诱导4 h后，发酵菌体的重组蛋白表达量同摇瓶培养表达水平相当(图2A). 发酵菌体裂解后取上清，经过NiNTA Superflow，SOURCE 30Q及Sephacryl S200HR纯化后，纯度可达90％以上(图2A). Western Blot结果显示，纯化后的目的蛋白能够与抗人MAGE3多克隆抗体特异性结合(图2B).
AM: 低分子质量蛋白标准; 1: 未诱导pETMH/BL21(DE3); 2: 摇瓶IPTG诱导pETMH/BL21(DE3); 3: 发酵罐IPTG诱导pETMH/BL21(DE3); 4: 纯化MAGE3/HSP70融合蛋白. B1: 低分子质量蛋白标准; 2: 未诱导pETMH/BL21(DE3); 3: 纯化MAGE3/HSP70融合蛋白; 4: 发酵罐IPTG诱导pETMH/BL21(DE3).
图2MAGE3/HSP70的原核表达与分离纯化（A）及Western Blot（B）结果（略）
2.3体外肿瘤免疫学试验
2.3.1ELISPOT检测分泌IFNγ的MAGE3特异性T细胞数量与PBS组比较，HSP70组、MAGE3+HSP70组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFNγ的T淋巴细胞频数没有明显变化，MAGE3组和MAGE3/HSP70组频数显著增加（P&<0.05），而且MAGE3/HSP70组频数显著大于MAGE3组（P&<0.01，图3）.
2.3.2细胞毒性实验采用LDH释放实验，结果显示，效靶比为5∶1，10∶1和50∶1时，HSP70组及PBS组诱导的CTL对B16MAGE3细胞无特异性杀伤作用；MAGE3组、MAGE3+HSP70 和MAGE3/HSP70组特异性杀伤作用显著增强，而且MAGE3/HSP70组特异性杀伤作用显著大于MAGE3组、MAGE3＋HSP70组（P&<0.01，图4）. 说明HSP70MAGE3融合蛋白疫苗能诱导产生MAGE3抗原特异性的CTL，对表达MAGE3的肿瘤细胞具有强大的特异性杀伤作用.
bP&<0.01 vs PBS； dP&<0.01 vs MAGE3.
图3ELISPOT检测蛋白疫苗免疫小鼠分泌IFNγ的T淋巴细胞频数（n=5， x±s）（略）
bP&<0.01 vs PBS； dP&<0.01 vs MAGE3.
图4蛋白疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞对B16MAGE3细胞的特异性杀伤（n=5， x±s）（略）
3讨论
肿瘤免疫治疗在预防肿瘤复发、转移及治疗微小残留肿瘤病灶等方面有其独特的优势，是肿瘤综合治疗的重要组成部分. 肿瘤免疫治疗的分子基础是肿瘤抗原可以激活机体特异性CTL杀伤肿瘤细胞. 黑色素瘤抗原(MAGE)是一种肿瘤特异性抗原，是肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子［1-2］. 其中MAGE3可以激活机体的细胞免疫系统，活化CTL特异性地识别并杀伤表达MAGE3的肿瘤细胞［3-4］. 重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白是我室研制和开发的一种新型肿瘤疫苗［5］，实验表明，它对肝癌、胃癌、乳腺癌等常见恶性肿瘤具有良好的治疗效果和预防效果，在肿瘤的治疗方面具有潜在的临床应用价值［6］. 作为广谱抗肿瘤药物的研究，其用量较大，为了得到大量的重组MAGE3/HSP70蛋白，就需要大量的诱导表达MAGE3/HSP70蛋白的基因重组菌体，而高密度发酵是获取大量基因重组菌体重要策略之一［7］.
基因工程菌的两阶段培养法是基因工程的一大进步，它是通过合适的诱导条件将工程菌的发酵过程分为菌体生长与产物表达两阶段，为了增加基因产品的时控产率，不仅需要提高工程菌的表达水平，同时必需增高菌体增殖密度［8-9］. 对于通过化学诱导表达目标蛋白的工程菌，诱导时机和诱导时间对菌体的生长密度和比生产率有较大影响. 在细菌的对数生长中期诱导比早期和后期诱导产率高，而且只有工程菌处于对数生长时期，目标蛋白的表达水平才最高，一旦工程菌进入稳定生长期，目标蛋白的表达水平迅速下降，可能与菌体内的酶体系有关. 在对数生长期菌体内的各种酶体系代谢旺盛，尤其是转录、翻译酶体系很活跃，而进入稳定生长期后，该酶体系活性减弱或代谢速度减慢，只能勉强进行转录和翻译，从而引起细菌生长状态下降，表达外源基因的能力也随之降低［10-11］， 所以应在对数中期进行诱导. MAGE3/HSP70工程菌活化6 h，A600 nm为12.3时处于对数生长期中，此时进行IPTG诱导，收菌量与目标蛋白的表达量都达到较高水平. 研究虽然对MAGE3/HSP70工程菌进行成功的发酵，但是收菌量还有待进一步提高，发酵条件还要进一步优化，以达到中试生产的要求. 在下步纯化过程工作中我们一方面要提高MAGE3/HSP70蛋白的可溶性表达，另外还要摸索包涵体的复性条件，以期提高蛋白的最后得率.
为了进一步明确发酵表达并纯化的MAGE3/HSP70在体内的抗肿瘤免疫活性，我们利用检测细胞免疫反应的通用方法，酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞毒性杀伤实验(LDH)检测了MAGE3/HSP70激活机体免疫反应的情况. 结果发现用MAGE3/HSP70免疫小鼠，刺激机体产生分泌IFNγ的T淋巴细胞频数显著高于PBS组，HSP70组，MAGE3+HSP70组以及MAGE3组. 同时LDH杀伤实验表明MAGE3/HSP70可以激活机体免疫系统产生特异性CTL杀伤表达MAGE3的肿瘤细胞，且显著高于其他各组，而对不表达特异性抗原的细胞没有杀伤作用. 说明MAGE3/HSP70在制备过程中保持了药物的性能. 本实验为MAGE3/HSP70的进一步应用奠定了基础.
【
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