作者：郭军 房殿春 姜锋 杨仕明
【关键词】 宫颈肿瘤；癌基因；HCCR
【Abstract】 AIM： To clone and construct the recombinant eukarotic plasmid of human cervical cancer oncogene HCCR2 and provide the premise for its application to study the mutual relation between HCCR2 and P53 in gastric cancer. METHODS: Total RNA was isolated from hepatocellular carcinoma cell line HepG2. Subsequently， a 1kb fragment of HCCR2 encoding region was amplified by RTPCR and cloned into Promega TEasy vector. After confirmed by DNA sequencing， the fulllength encoding region of HCCR2 was amplified by PCR and cloned into pIRES2EGFP. The recombinant eukaryotic expression vector was confimed by DNA sequencing. RESULTS: A 1 kb fragment and a 0.9 kb fragment of HCCR2 was successfully amplified by RTPCR and PCR respectively. DNA sequencing suggested that both HCCR2/T and pIRES2EGFP/HCCR2（+） possesses correct read frame and nucleotide sequence of HCCR2. CONCLUSION: The pIRES2EGFP/HCCR2（+） was successfully constructed and this laid a solid foundation for uncovering the carcinogenic mechanism of HCCR2.
【Keywords】 cervical neoplasms; oncogene; HCCR2 gene
【摘要】 目的：克隆人子宫癌基因HCCR2并构建其真核表达载体，为研究其在人胃癌细胞中与P53的相互作用关系奠定基础. 方法：从人肝癌细胞株HepG2提取RNA，利用RTPCR方法，先克隆出一包括HCCR2编码区的长约1 kb的片段，并将其与T载体连接并转化，测序证实无误后，以HCCR2/T载体为模板，再通过PCR克隆出HCCR2的编码区序列，将其连接到pIRES2EGFP真核表达载体，并通过测序获得证实. 结果：RTPCR扩增出一长约1 kb的HCCR2片段，PCR扩增出约0.9 kb大小的目的片段，HCCR2/T，pIRES2EGFP/HCCR2（+） DNA测序均表明编码序列及读框完全正确. 结论：成功构建HCCR2真核表达载体pIRES2EGFP/HCCR2（+），为进一步研究其致癌机制打下基础.
【关键词】 宫颈肿瘤；癌基因；HCCR2基因
0引言
HCCR2是Ko等［1］用差异显示RTPCR方法从人子宫颈癌组织筛选并鉴别出来的一新的癌基因，HCCR2为一Ⅱ型跨膜蛋白，由304个氨基酸组成，相对分子质量为36 ku，其基因定位于12号染色体，由9个外显子构成. HCCR2在各种恶性肿瘤如白血病、淋巴瘤、乳腺、肾、胃、结肠、卵巢癌中RNA及蛋白质均过度表达，这意味着HCCR2在人的多数恶性肿瘤发展中具有重要作用［1-2］. 因此，我们拟通过构建HCCR2真核表达载体，为下一步转染胃癌细胞，研究其在胃癌细胞中与其他肿瘤相关基因相互作用的机制奠定基础.
1材料和方法
1．1材料HepG2细胞株、质粒pIRES2EGFP及大肠杆菌DH5α为本室保存，Promega Teasy Vector为Promega产品. 主要试剂Pyrobest Taq DNA聚合酶(宝泰克公司); Trizol，T4 DNA ligase，SalI，XhoI，PvuII (上海生工公司); 质粒提取、凝胶回收试剂盒(Invitrogen公司). 根据HCCR2基因序列，设计两对引物，由上海生工公司合成，序列如下 P1：5′ CTCCAAAGGCAGATGTGAAGAA 3′; P2： 5′ GCTGTTTGTTCCTGCACTGCTA 3′； P3： 5′ GCGTCGACTGATGTCTTATGTGGTAAC 3′（下划线为SalI酶切位点）; P4： 5′ CCGCTCGAGTTCATTCAGCGCCT 3′（下划线为Xho I酶切位点）.
1．2方法①肝癌细胞HepG2总RNA提取：在含100 g/L小牛血清的MEM中常规培养HepG2，待细胞增至5×109，用Trizol一步法裂解细胞提取总RNA，用紫外分光光度计测量260/280 nm吸光度比值，RNA变性凝胶电泳检测. ②RTPCR: 以提取的RNA为模板，RT条件为：oligo（dT）18 （0.5 g/L） 1 μL，总RNA 5 μL，去离子水h3O 6 μL，70℃ 5 min，立即冰浴，随后依次加入5×reaction buffer 4 μL，RNA酶抑制剂（20×106 U/L） 1 μL， dNTP (10 mmoL/L) 2 μL，依次37℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min. PCR（引物为P1，P2）：94℃ 2 min，随后加入Pyrobest Taq DNA聚合酶0.25 μL(1.25 U)；94℃ 30 s，65℃→55℃ 30 s，72℃ 1 min 10个循环，每个循环降1℃，10个循环后退火温度从65℃降到55℃；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，再加入普通rTaq 1 μL(5 U)，加A尾，72℃ 20 min. ③胶回收PCR产物并与Promega TEasy Vector连接并转化，进行蓝白斑筛选，按说明书进行，对白色克隆用PvuII进行酶切鉴定并测序. 测序证实后，以含有目的片段的测序载体为模板，进行PCR（引物为P3，P4）：94℃ 5 min，94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 2 min，35个循环，72℃延伸10 min. ④将第2次PCR获得的目的片段通过酶切与酶切线形化的pIRES2EGFP连接、转化，构建pIRES2EGFP/HCCR2（+），挑取重组质粒克隆，扩增后用PCR鉴定并测序.
2结果
2．1RTPCR总RNA电泳显示28S，18S，5S条带清晰，260 nm/280 nm吸光度比值为1.8. 以P1，P2为引物的RTPCR产物1.2 g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示：2，3泳道为非特异性产物，第4泳道扩增出预期大小的目的片段，大小约1 kb（图1）.
1：DL2000 marker；2，3：非特异性产物;4：RTPCR产物.
图1RTPCR扩增产物（略）
2．2Promega TeasyVector重组质粒的酶切鉴定及测序挑取3个白色克隆，扩增、提取质粒后，用PvuII酶切鉴定重组质粒，只有1号克隆切出大小约0.5 kb，0.9 kb两个片段（图2），与预期相符，意味着1号克隆目的片段正向插入TeasyVector，北京三博远志生物公司测序结果表明，所获得的基因片段与已报道序列完全相同（GenBank AF315598）.
图2重组质粒的酶切鉴定（略）
2．3pIRES2EGFP/HCCR2（+）重组质粒的PCR鉴定及测序挑取重组pIRES2EGFP/HCCR2（+）克隆，扩增提取质粒后经PCR鉴定（引物P3，P4），1号扩增出一约0.9 kb大小的片段（图3），与预期片段大小吻合. 北京三博远志生物公司测序结果表明，重组质粒pIRES2EGFP/HCCR2（+）其HCCR2基因编码序列（图4）及读框完全正确.
1：pIRES2EGFP/HCCR2（+）重组质粒; 2： DL2000 marker.
图3重组质粒pIRES2EGFP/HCCR2（+）的PCR鉴定（略）
图4HCCR2编码区核苷酸序列（略）
3讨论
人子宫颈癌基因HCCR2是近年发现的与人类多种肿瘤相关的基因，它是韩国Ko等［1，3］用差异显示RTPCR法从原发子宫颈癌组织、转移淋巴结灶及子宫颈癌细胞系CUMC6筛选、鉴定出来的. 它可作为抑癌基因P53的负向调控因子，引起肿瘤的发生. 尽管HCCR2最早发现于人宫颈癌，但其蛋白浓度在宫颈癌患者血清中未见升高，在乳腺癌、肝癌患者血清中却升高［4-5］. Yoon等［4］制备了针对HCCR167360HCCR单克隆及多克隆抗体，并应用于人肝癌研究. 免疫组化揭示HCCR蛋白主要定位于细胞的质膜和胞质，其在肝癌组织细胞呈强阳性，在肝硬化组织细胞中呈弱阳性，而在正常组织细胞中则为阴性［4］. 在从肝硬化到肝癌的进程中，HCCR对早期发现肝硬化发生癌变，以及HCCR在诊断早期肝癌及小肝癌等方面明显优于AFP［4］. Jung等［5］研究发现，HCCR在早期发现乳腺癌及诊断乳腺癌方面均优于CA153.
SalI，XhoI为同尾酶，能产生相同的粘性末端，两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割. 因此，尽管P3，P4引物所加限制性酶切位点SalI，XhoI与pIRES2EGFP多克隆酶切位点位置相反，但目的片段却可以以正向插入.
虽然HCCR2用于临床肿瘤的检测具有很好的前景，但作为一新的致癌基因，其自身激活、致癌机制以及与其他分子的相互作用等尚未完全阐明，因此，我们通过RTPCR成功构建了HCCR2真核表达载体，为进一步研究其功能提供了实验基础.
【
参考文献
】［1］ Ko J， Lee YH， Hwang SY， et al. Identification and differential expression of novel human cervical cancer oncogene HCCR2 in human cancers and its involvement in p53 stabilization［J］. Oncogene， 2003，22(30):4679-4689.
［2］ Chung YJ， Kim JW. Novel oncogene HCCR: Its diagnostic and therapeutic implications for cancer［J］. Histol Histopathol， 2005，20(3):999-1003.
［3］ Ko J，Shin SM，Oh YM，et al. Transgenic mouse model for breast cancer: Induction of breast cancer in novel oncogene HCCR2 transgenic mice［J］. Oncogene， 2004，23(10):1950-1953.
［4］ Yoon SK，Lim NK，Ha SA，et al. The human cervical cancer oncogene protein is a biomarker for human hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Res， 2004，64(15):5434-5441.
［5］ Jung SS，Park HS，Lee IJ，et al. The HCCR: Oncoprotein as a biomarker for human breast cancer［J］. Clin Cancer Res， 2005，11(21):7700-7708.