作者：林汉军 戚好文 方丽萍
【关键词】 二氧化硫；免疫组化；感觉神经；P物质
【Abstract】 AIM: To study the pathological changes of airway injury and the effect on the axon reflex of sensory nerve by the sulfur dioxide （SO2） of low concentration. METHODS： Sixteen SD male rats were pided randomly into 2 groups: control group and SO2 group. The control group was exposed to pure air. SO2 group was exposed to SO2 at the concentration of 1.0 mg/(m3・h)， 6 h daily for consecutive 3 d. At 4th day， we collected the bronchoalveolar lavage fluid (BALF)， plasma and lung tissue. Then we counted the total cell number in BALF， measured the plasma SP content and performed the immunohistochemical staining (HE and SP methods) on the lung tissue. RESULTS: Compared with the control group， the total cell number in BALF and plasma SP content in SO2 group increased significantly (P&<0.01). HE staining showed there were a great deal of inflammatory cell infiltration under the tunica mucosa bronchiorum; and SP immunohistochemical staining indicated there was a significant increase in the number of SPIR positive fibers in SO2 group (P&<0.05 vs control group). CONCLUTION: Exposure to low concentration of SO2 would injure healthy rat airway， and one of its mechanisms is neurogenic inflammation that can exacerbates the response of airway inflammation.
【Keywords】 sulfur dioxide; immunohistochemistry; sensory neuron; substance P
【摘要】 目的: 探讨低浓度SO2损伤大鼠气道病理变化和对感觉神经轴突反射的影响. 方法:SD雄性大鼠16只，随机分为对照组和SO2组. 对照组暴露于正常空气中. SO2组暴露于1.0 mg/(m3・h)浓度的SO2室内空气中，每日6 h，连续3 d. 第4日采集血清、收集支气管肺泡灌洗液(BALF)， 留取肺组织. 分别进行BALF细胞计数，测血清中P物质（SP）的含量，作肺组织病理切片行HE及SP免疫组化染色. 结果:SO2组与对照组比较，BALF中细胞总数明显升高(P&<0．01)；血清SP含量显著增加(P&<0．01). 肺组织病理切片HE染色显示SO2组支气管黏膜下有大量炎性细胞浸润；免疫组化染色提示SO2组SP免疫阳性神经纤维数量明显增加(P&<0.01). 结论：SO2是损伤气道的重要病理因素，气道内感觉神经参与了气道损伤病理过程.
【关键词】 二氧化硫；免疫组化；感觉神经；P物质
0引言
二氧化硫（SO2）是大气污染中的最主要成分，它是一种辛辣、窒息性气体，能使呼吸系统生理功能减退，肺泡弹性减弱，肺功能降低，引起气管炎、支气管哮喘、肺气肿等. 特别是SO2与另一种空气污染物-可吸入性颗粒物的协同作用对人体健康危害性更大. 流行病学调查显示空气中SO2浓度超过0.15 mg／m3、颗粒物浓度超过2.0 mg／m3时，呼吸系统疾病的住院率明显上升［1］. 对于已存在有呼吸系统疾病的患者，SO2浓度升高可使患者咳嗽、咳痰、呼吸困难等症状加重，以及肺功能下降［2］. 但是SO2损伤气道的相关病理机制并不十分清楚. P物质(SP)是存在于气道内无髓鞘感觉神经（C纤维）中的一种神经肽，SP释放能增加气道内黏液分泌物的分泌以及气道平滑肌收缩［3］. 本实验我们以模拟空气污染中SO2的浓度作为刺激因子，通过吸入观察SO2对气道内感觉神经的刺激作用及气道形态学的改变，探讨SO2损伤气道诱发哮喘及慢性气管炎的机制，为呼吸系统疾病的防治以及环保的治理提供理论依据.
1材料和方法
1．1材料二级雄性SD大鼠，6周龄，16只，体质量(120±5)g，购自第四军医大学实验动物中心. 1×10-7 mL/L SO2气体购自北京普莱克斯实用气体有限公司；大鼠血清SP的ELISA检测试剂盒购自美国Rapid BioLab公司；抗SP兔抗大鼠一抗及免疫组化染色试剂盒购于武汉博士德生物有限公司.
1．2方法
1．2．1动物分组将大鼠随机分为2组即对照组和SO2组；每组8只. 对照组置于过滤空气室内. SO2组暴露于1.0 mg/(m3・h)（甲醛吸收副玫瑰苯胺分光光度法）浓度的SO2室内空气中，每日6 h，连续3 d. 整个实验过程控制温度和湿度变化在±10％以内. 室内SO2浓度由西安市室内环境监测站协助监测.
1．2．2组织标本制作实验动物在SO2暴露结束后第2日后用戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg)，从腹主动脉取血4 mL，注入试管中. 凝固后分离血清，在4℃条件下，3000 r／min离心10 min，取上清液，待测血清中SP含量. 随即结扎大鼠右肺，用37℃生理盐水2 mL作左肺支气管肺泡灌洗3次，支气管肺泡灌洗液（BALF）回收率约80％. BALF 1500 r／min离心10 min，加入与BALF等体积的生理盐水重悬沉淀的细胞，-20℃冻存. 分离心肺，将输液器针从右心室刺入肺动脉，动脉夹固定，剪掉左心耳，先用生理盐水量约100 mL灌注，待流出液清亮时，40 mL/L多聚甲醛50 mL灌注，固定24 h，入200 g/L蔗糖PS溶液中，4℃过夜. 恒冷箱切片，片厚分别为8 μm和16 μm， 待做HE常规染色及免疫组化染色.
1．2．3BALF细胞计数取BALF细胞悬液1滴置入血细胞计数板中，光镜下分别计数各组BALF中细胞总数.
1．2．4血清SP含量测定取血清上清液，用ELISA法测血清SP含量，具体操作步骤参照ELISA试剂盒说明进行.
1．2．5病理观察取8 μm冰冻切片，常规HE染色，显微镜下观察.
1．2．6免疫组化染色取16 μm冰冻切片，室温下干燥，甲醇双氧水封闭组织内过氧化物酶，小牛血清封闭非特异性抗体，加入1∶200兔抗大鼠SP抗体，4℃过夜，滴加链亲和霉素复合物（SABC），最后以葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍铵法显色. 常规脱水、透明、封片. 显微镜下计数细支气管内［直径(400±30) μm］ SP免疫阳性神经纤维数. 对照组以PBS代替1∶200兔抗大鼠SP抗体，其余步骤相同.
统计学处理： 所有数据以x±s表示， 采用SPSS 11.0统计软件进行处理， 组间比较采用t检验， 组间方差不齐时采用t′检验， P&<0．05认为有统计学差异.
2结果
2．1BALF细胞总数对照组（n=8）为(3.1±1.1)×106/L，SO2组（n=8）为(17.5±5.2)×106/L， 两组比较，SO2组BALF细胞总数显著升高(P&<0.01).
2.2血清SP含量对照组（n=8）为(35.9±18.7) pg/L，SO2组（n=8）为(85.3±39.9) pg/L，两组比较，SO2组血清SP含量显著升高(P&<0．01).
2.3病理观察与对照组相比，SO2组支气管黏膜上皮纤毛粘连、变短、倒伏，黏膜下层及平滑肌层可见大量炎性细胞浸润（图1）.
A：正常细支气管； B：SO2组支气管黏膜上皮纤毛粘连、倒伏，黏膜下及平滑肌层见可见大量炎性细胞浸润.
2．4免疫组化染色对照组（n=8）为6.9±2.7， SO2组（n=8）为15.6±4.5，两组比较，SO2组SP免疫阳性神经纤维计数高于对照组(P&<0．01， 图2）.
A：正常大鼠支气管; B：SO2组SP免疫阳性神经纤维数量明显增加.
图2免疫组化染色SP ×200（略）
3讨论
环保与健康是世界各国政府所共同关心的课题，尤其是对空气的污染的治理更为关心. 空气污染能诱发许多呼吸系统疾病的发生与发展，例如肺癌，慢性气管炎，慢性支气管哮喘等. 大量的流行病学研究表明，哮喘的发病与空气污染有关. 美国加利弗尼亚南部的研究发现，PM10（直径＜10 μm的可吸入颗粒物）浓度升高，可加重哮喘儿童的症状. 另外的研究发现，O3的浓度每上升一个百分点，儿童的肺功能指标FEV1则下降50 mL［4］. 在对我国广州、武汉、兰州、重庆四城市的调查发现，空气污染可使儿童肺活量等肺功能降低，对已患有呼吸系统疾病的儿童尤为明显，提示工业区大气污染是影响儿童呼吸系统健康的危险因素［5］. 荷兰的一项研究表明，患有哮喘的儿童比未患哮喘的儿童对空气污染的反应更为敏感，且治疗哮喘的药物不能阻止空气污染所致的不良反应［6］.
SO2是空气污染物的主要成分之一，流行病学调查发现当空气中SO2浓度升高后，呼吸系统疾病的住院率明显上升. 对于已存在有呼吸系统疾病的患者，空气中SO2浓度升高可使患者咳嗽、咳痰、呼吸困难等症状加重，肺功能下降. 关于SO2诱发哮喘及慢性气管炎的机制非常复杂，这也正是目前各国研究的热点. 有关研究显示，在SO2长期持久的作用下，可使呼吸道防御机能受到破坏，SO2可改变气道pH值；刺激气道产生大量氧自由基；并促使多种细胞因子如TNFα， IL1， IL6， IL8释放增加；也可通过刺激气道内副交感神经引起气道平滑肌收缩［7-8］. 目前，气道内的另一种神经调节机制引起了研究者的广泛兴趣：气道内的无髓鞘传入迷走神经（C纤维）因外界刺激而损伤后，可通过轴突反射，从感觉神经的侧突分枝释放SP， 速激肽（TK）， 降钙素基因肽（CGRP）等感觉神经肽［9］. SP是一种中枢和周围神经递质，肺内支气管和血管上有广泛的SP受体存在，SP与受体结合后可引起支气管平滑肌收缩，血浆渗出和腺体分泌增加［10］. 本实验显示以低浓度SO2刺激气道后，血清中SP含量明显升高，支气管SP免疫阳性神经纤维数量也显著增加，其改变与BALF细胞数和肺组织病理改变一致. 从而说明由肺内感觉神经介导的神经源性炎症参与了SO2损伤气道的过程， SO2是损伤气道的重要病理机制之一，从而促进了慢性支气管炎与哮喘的发生与发展.
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