作者：张燕 王保莉 苏金 车红磊 于江天 刘新平
【关键词】 ，盘状结构域受体2；Fc；DS区域；融合表达
【Abstract】 AIM: To construct the eukaryotic expression vector of DDR2Fc fusion gene and to investigate its expression in HEK293 cells. METHODS: The two cDNAs was amplified by PCR respectively from the rat brain tissue and the plasmid containing the fulllength cDNA of human IgG1 Fc，and cloned to the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-) by directional cloning. The resultant recombinant plamid pcDNA3.1(-)/DDR2Fc was transfected into HEK293 cells with liposome transfection reagent. Then RTPCR， Western Blot were used to detect the expression of the fusion protein. RESULTS: DNA sequencing and restriction enzyme digestion verified the correction of recombinant plasmid pcDNA3.1(-)/DDR2Fc. The expressed fusion protein was detected in the transfected HEK293 cells and the molecular weight of the protein was the same as we expected. CONCLUSION: The recombinant plasmid pcDNA3.1(-)/DDR2Fc was successfully constructed and the fusion protein DDR2/ Fc was expressed in HEK293 cells.
【Keywords】 discoidin domain receptor 2；Fc；DS domain；fusion expression
【摘要】 目的:构建DDR2/Fc真核表达载体，使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术，分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段，以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中，获得重组表达载体DDR2/FcpcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RTPCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点，细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达，其分子质量与预期大小一致，该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体，表达了融合蛋白.
【关键词】 盘状结构域受体2；Fc；DS区域；融合表达
0引言
盘状结构域受体2(discoidin domain receptor 2，DDR2)是一种受体型蛋白酪氨酸激酶，其配体为纤维性胶原. 胶原刺激DDR2使其活化，DDR2作用于下游信号通路分子最终导致基质金属蛋白酶(MMPs)的表达水平上调［1-2］. DDR2在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)患者滑膜中呈过表达状态［3］，这些过度表达和活化的DDR2调节下游信号通路产生大量MMPs，从而降解关节软骨中的主要成分Ⅱ型胶原，最终进一步破坏软骨和骨［4］. 因此，研究和制备Ⅱ型胶原DDR2MMPs这一信号通路的竞争性阻断剂有重要意义. 我们将DDR2中负责与Ⅱ型胶原结合的区域DS domain［5］与IgG1 Fc段融合起来在293细胞中进行表达，使其具备有活性的二聚化状态，为进一步研究其竞争性阻断剂功能奠定基础.
1材料和方法
1.1材料雄性SD大鼠（第四军医大学实验动物中心）；293细胞、pcDNA3.1(-)真核表达载体、大肠杆菌XL10菌株(本室保存)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；DMEM培养基(Gibco公司)；抗Fc抗体(第四军医大学免疫教研室惠赠)；Western Blot发光底物Super Signal Femto Substrate Kit（Pierce公司）；RNA反转录试剂（Promega公司）；用于PCR反应的引物（上海生物工程公司合成）；pfu高保真聚合酶，Taq酶，dNTP，dATP，各种限制性内切酶，pMD18T载体，T4DNA连接酶（TaKaRa公司）；质粒提取和DNA回收试剂盒（安徽优晶公司）.
1.2方法
1.2.1引物设计DDR2的DS domain片段（命名为DS）的上游引物序列：5′TCT AGA GTC GAC CTG AAA TGA TCC TGA TTC CCA GAA TG3′，其中TCT AGA序列为XbaⅠ酶切位点；DS的下游引物序列：5′GGT ACC TCC ACA ACC ATA AAG CTC GAC CCT CAT G3′，其中GGT ACC序列为KpnⅠ酶切位点，TCC为额外引入的序列，将翻译成2个片段之间的柔性氨基酸Gly. Fc段的上游引物序列： 5′GAA TTC GGT ACC GGA GGC GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA AC3′，其中GAA TTC序列为EcoRⅠ酶切位点，GGT ACC序列为KpnⅠ酶切位点，GGA GGC为引入的序列，将翻译成两个片段之间的柔性氨基酸GlyGly；Fc段的下游引物序列： 5′AAG CTT TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG3′，其中AAG CTT序列为HindⅢ酶切位点，TCA为终止码的反向互补序列.
1.2.2模板制备及RNA反转录取大鼠脑组织0.1 g，用Trizol法提取总RNA. 取总RNA 1 μg加入oligo（dT）15 2 μL，70℃温育10 min，再加入5×RT buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L） 2.5 μL，AMV 1 μL，补DEPC水至25 μL，于42℃下反应1 h后95℃ 5 min终止反应.
1.2.3PCR扩增及产物修饰在200 μL反应体系中加入10×buffer 20 μL，dNTP（10 mmol/L）4 μL、上下游引物（10 μmol/L）各4 μL、模板DNA(脑组织cDNA，Fc质粒)各8 μL，pfu 4 μL，Taq 1.2 μL，补水至200 μL. PCR扩增条件为94℃ 5 min，94℃ 1 min，52℃ 1 min，68℃ 2 min，后3步进行35个循环，最后，68℃延伸10 min. 扩增产物回收后溶于30 μL TrisHCl（pH 8.0）中，并进行加“A”反应.
1.2.4PCR产物克隆及序列测定上述加“A”后的PCR产物回收后直接与pMD18T载体连接，转化大肠杆菌XL10后，挑选克隆进行EcoRⅠ/HindⅢ酶切，鉴定片段是否插入pMD18T载体中. 将阳性克隆送公司测序，将测序结果与GenBank中的基因序列进行比对.
1.2.5融合表达载体的建立和鉴定EcoRⅠ/HindⅢ酶切FcpMD18T，将Fc片段切下，插入pcDNA3.1(-)中，并用EcoRⅠ/HindⅢ进行酶切鉴定. 再用XbaⅠ/KpnⅠ将DSpMD18T中的DS切下，连入同样酶切过的FcpcDNA3.1(-)，构建成DS/FcpcDNA3.1(-)，用XbaⅠ/KpnⅠ，KpnⅠ/HindⅢ，EcoRⅠ/HindⅢ分别进行酶切鉴定.
1.2.6HEK293细胞的培养及质粒瞬时转染HEK293细胞用含有100 mL/L小牛血清的DMEM培养，转染前24 h传代，接种入6孔板中. 待转染细胞共分3组，分别是DS/FcpcDNA3.1(-)组、空载体pcDNA3.1(-)组和空对照组. 当细胞长至80％时转染：将10 μL Lipofectamine2000与4 μg待转染质粒混合，室温静置20 min后用于孵育细胞，培养16 h后换无血清的DMEM培养基继续培养48 h，收获细胞.
1.2.7细胞总RNA的提取及RTPCR检测mRNA的表达收获细胞，一部分用Trizol提取细胞总RNA，AMV进行反转录，以DS上游引物和Fc下游引物进行DDR2/Fc的扩增，同时设立GAPDH为内参照，扩增GAPDH所用上游引物为5′ATC AGA AGG GTG TGA ACC AC3′，下游引物为5′AAG TCG CAG GAG ACA ACC TG3′.
1.2.8Western Blot检测蛋白表达细胞用冰PBS洗涤，4℃下12 000 g离心10 min，弃去上清，加入裂解液（50 mmol/L Trisbase， pH 7.6， 150 mmol/L NaCl， 1 mol/L EDTA， 10 mL/L NP40， 1 mmol/L PMSF， 10 mg/L Pepstatin， 10 g/L Leupeptin）悬浮，冰浴30 min，并用1 mL注射器反复吹打. 4℃下12 000 g离心10 min，取上清，和上样缓冲液混合后走120 g/L SDSPAGE胶，电转移至NC膜，50 g/L脱脂奶室温封闭1 h，抗Fc抗体室温孵育1 h，50 mmol/L TrisHCl，10 g/L Tween20洗膜10 min×3次，并与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h. 洗膜后用Super Signal Femto Substrate Kit孵育发光，曝光于X光片上.
2结果
2.1DS和Fc片段的扩增、克隆及序列分析DS的PCR产物为555 bp的特异性条带，Fc PCR产物为696 bp的特异性条带. EcoRⅠ/HindⅢ分别酶切DSpMD18T，FcpMD18T进行鉴定，得到了预期600 bp和720 bp的条带(图1).测序结果表明，PCR扩增获得并克隆的DS和Fc片段序列完全正确.
2.2融合表达载体的建立和鉴定用EcoRⅠ/HindⅢ将Fc片段切下插入pcDNA3.1(-)中，用EcoRⅠ/HindⅢ进行酶切鉴定，得到了预期720 bp的条带(图2A)；用XbaⅠ/KpnⅠ将的DS切下插入鉴定后的FcpcDNA3.1(-)中，挑克隆分别用XbaⅠ/HindⅢ，XbaⅠ/KpnⅠ，KpnⅠ/HindⅢ进行鉴定，得到了预期1300，570，710 bp的条带(图2B).
AM: DNA marker; 1: DS PCR产物; 2: Fc PCR产物. BM: DNA marker; 1～3: EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定重组载体DSpMD18T. CM: DNA marker; 1～3: EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定重组载体FcpMD18T.
图1PCR产物及重组载体的鉴定（略）
AM: DNA mrker; 1～4: EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定重组载体FcpcDNA3.1(-): 1为假阳性克隆， 2~4为阳性克隆. BM: DNA mrker; 1: XbaⅠ/HindⅢ酶切鉴定重组载体DS/FcpcDNA3.1(-)体; 2: XbaⅠ/KpnⅠ酶切鉴定重组载体DS/FcpcDNA3.1(-)体; 3: KpnⅠ/HindⅢ酶切鉴定重组载体DS/FcpcDNA3.1(-).
图2FcpcDNA3.1(-)和DS/FcpcDNA3.1(-)重组质粒的酶切鉴定（略）
ADS mRNA的鉴定. M:DNA mrker; 1: DS/FcpcDNA3.1(-); 2: pcDNA3.1(-)mock; 3: mock.
BGAPDH mRNA的鉴定. M:DNA mrker; 1: DS/FcpcDNA3.1(-); 2: pcDNA3.1(-)mock; 3: mock.
图3RTPCR鉴定DS mRNA表达（略）
1:mock; 2:DS/FcpcDNA3.1(-)； 3:pcDNA3.1(-)mock.
图4Western Blot鉴定DDR2/IgG重组融和蛋白的表达（略）
3讨论
DDR2属于近年来发现的一类胶原受体家族，目前发现该家族包含两个成员：DDR1和DDR2，前者主要表达于脑，胃肠道，肺和肾的上皮细胞，后者则主要表达于心、骨骼肌、肺、脑和肾的间质细胞. DDR2参与许多细胞基本的生理进程，如细胞增殖，分化，迁移和代谢，在控制软骨细胞增殖和骨骼生长中发挥重要作用［6］.
DDR2不同于其他RTK，它的配体是胞外的主要组分-三螺旋胶原［1］，DDR2在胶原的刺激下可以长时间保持活化状态，并上调某些基质金属蛋白酶分子（MMPs）表达［2，7］. DDR2通过调节MMPs的表达及活性来控制细胞外基质的再折叠，调节细胞增殖、黏附和迁移. 在RA患者滑膜中高表达状态的DDR2调节下游信号通路产生大量MMPs， 从而降解关节软骨中的主要成分Ⅱ型胶原， 最终进一步破坏软骨和骨［3-4，7］. 因此研究并制备Ⅱ型胶原DDR2MMPs这一信号通路的阻断剂， 使其阻断胶原受体与软骨的相互作用， 会为将来临床上治疗RA提供新的候选药物.
在DDR2与Ⅱ型胶原的结合过程中，DDR2的二聚化状态是必须的，且其结合域为DS domain［5］，因此我们选用DDR2的DS domain与IgG的铰链区及Ch3CH3区，将其在基因水平融合，期望获得两者的融合表达蛋白. 采用DDR2与Fc融合，主要有以下几下几个原因:①利用Fc的二硫键使DDR2形成二聚体，使其具有与Ⅱ型胶原结合的构象，通过竞争性结合Ⅱ型胶原抑制它与天然受体结合进而阻断DDR2MMPs这一信号通路；②可利用蛋白A亲和层析， 将融合蛋白从细胞培养上清中回收并纯化，简化后续的蛋白纯化工作；③引入Fc可延长重组蛋白的半衰期，使其更适合于在体内应用，方便后续的动物实验. 在设计融合策略时，我们利用KpnⅠ酶切位点序列GGTACC，在两个片段之间引入GGA和GGAGGC，形成GGAGGTACCGGAGGC，这一序列将被翻译成为GlyGlyThrGlyGly，它们是一段柔性序列，不会造成空间位阻而影响DDR2和Fc的功能.
我们成功地构建了DDR2/IgG融和表达载体，并在HEK293细胞中进行了表达，为下一步研究DDR2 DS domain 功能奠定了基础.
参考文献
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［3］ Migita K. The role of protein kinase in human synovial fibroblast growth［J］. Biochem Biophys Res Commun，1995，210：1066-1075．
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［5］ Leitinger B. Molecular analysis of collagen binding by the human discoidin domain receptors， DDR1 and DDR2［J］. Biol Chem，2003，278：16761 - 16769．
［6］ Vogel W. Discoidin domain receptors：structural relations and functional implications［J］. FASEB，1999，13 Suppl：S77-S82．
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