作者：赵志敬 王晓斌 穆润花 刘毅 孙冬冬 李志超 王海昌 董明清
【关键词】 ，心肌/细胞学；钾通道；细胞系
【Abstract】 AIM: To establish a cell line stably expressing human cardiac Kv1.5 potassium channel. METHODS: Human cardiac hKv1.5 gene was transfected into HEK 293 cells. G418 at 1 mg/mL was used to select the transfected cells. After 2 weeks for selection， the antiG418 cell clones were further identified with patchclamp method， and whole cell currents were recorded. RESULTS: hKv1.5 gene was successfully transfected into HEK 293 cells. The expressed hKv1.5 currents were ultrarapid outward currents with obvious voltagedependence. Its average amplitude was (3.20±0.60) nA and its activation voltage was about -30 mV. CONCLUSION: The cell line stably expressing human atrial Kv1.5 channels has been successfully established， which has the similar characteristics of human atrial IKur. The established cell line can be used as a cell model for studying in vitro human atrial IKur.
【Keywords】 myocardium/cytology; potassium channels; cell line
【摘要】 目的：建立稳定表达人心房肌细胞Kv1.5钾通道的细胞系. 方法：将编码人心房Kv1.5钾通道的hKv1.5基因转染HEK 293细胞，用1 g/L G418筛选2 wk后采用膜片钳方法筛选具有抗G418抗性的细胞克隆，电流记录模式为全细胞记录. 结果：hKv1.5通道基因被成功转入HEK 293细胞并稳定表达；稳定表达的hKv1.5电流是具有明显电压依赖性和超快激活特点的外向电流，其电流大小为（3.20±0.60）nA，其激活电压在-30 mV左右.结论：成功构建稳定表达人心房Kv1.5钾通道蛋白的HEK 293细胞系，其电流特性与人心房肌IKur相似，可以作为体外研究人心房IKur的细胞模型.
【关键词】 心肌/细胞学；钾通道；细胞系
0引言
超快激活延迟整流钾电流（ultrarapid delayed rectifier potassium current，IKur）是心房肌细胞动作电位复极的主要外向离子流 ［1］. Kv1.5基因编码IKurα亚单位，是IKur的主要分子基础［2－4］，在人的心脏，IKur仅存于心房肌而不存在于心室肌. 因此，IKur是房性心律失常特异性治疗药物的潜在靶位［5-7］. 由于人心肌标本来源困难、心肌细胞多种电流成分相互影响，国内外多采用瞬时转染技术在体外表达离子通道基因来研究人心肌细胞通道功能，而有关稳定转染人hKv1.5通道的细胞系建立的研究报道较少. 我们将人hKv1.5基因转染HEK293细胞，经反复筛选鉴定，成功建立了稳定表达hKv1.5通道的细胞系，其电生理特性与人心房肌细胞IKur相似，是一种较理想的人心房肌IKur细胞模型.
1材料和方法
1.1材料HEK 293细胞系(American Type Culture Collection公司)；DMEM，Lipofectamine 2000，胎牛血清(Invitrogen公司)；hKCNA5/pBKCMV质粒（带G418抗性基因）由Dr.GR Li (University of Hong Kong)惠赠；G418及其它试剂均购自SigmaAldrich公司；Axopatch300B膜片钳放大器(Axon公司).
1.2方法
1．2．1细胞培养、基因转染及克隆筛选HEK 293细胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基于37℃， 50 mL/L CO2培养箱中培养，按照说明书操作步骤用Lipofectamine2000将含有hKv1.5基因的pBKCMV质粒转染至HEK 293细胞，采用G418，免疫荧光染色，膜片钳等方法筛选，鉴定稳定表达人心房肌hKv1.5钾通道蛋白的HEK 293细胞系，具体步骤如下：共转染hKv1.5基因的HEK 293细胞首先用1 g/L G418筛选2 wk，选取具有抗G418抗性的细胞克隆；用膜片钳方法逐个鉴定有无Kv1.5电流表达，将高表达目标电流的克隆在500 mg/L G418的培养液中传代培养，并通过膜片钳方法反复筛选鉴定，最后获得稳定表达Kv1.5通道蛋白的细胞克隆1个，将该克隆维持培养于含 500 mg/L G418，100 mL/L 胎牛血清的DMEM培养基中.
1．2．2溶液配制电极内液(mmol/L)：KCl 20， 天门冬氨酸钾110， MgCl2 1.0， HEPES 10， EGTA 5， GTP 0.1， 磷酸肌酸钠5， Mg2ATP 5，KOH调pH至7.2；细胞外液(mmol/L)：NaCl 140，KCl 5.0， MgCl2 1.0， HEPES 5.0， Kh3PO4 0.33，葡萄糖10，NaOH调pH至7.4.
1．2．3膜片钳实验膜片钳实验前1 d将未转染或转染hKv1.5基因的细胞接种于盖玻片上，第2日将贴附有细胞的小载玻片移入倒置显微镜载物台上的灌流槽中，细胞外液灌流5 min后开始实验，所有实验均在室温（21℃）下进行. 玻璃电极用Sutter P97电极拉制仪拉制，充灌电极内液后电极电阻1～3 MΩ，3 mol/L KCl琼脂糖盐桥电极作为参考电极，采用全细胞记录模式记录电流. 细胞钳制于-80 mV，先给予持续时间300 ms， 范围-40 mV~+60 mV的去极化刺激电压，步幅为10 mV，然后给予持续100 ms的-40 mV的复极化刺激，刺激频率为1 Hz，电流幅度大小测量值为去极化刺激结束前5 ms的平均值. 实验中所获电流信号经放大器滤波（2k Hz）放大后储存于IBM兼容计算机用于分析.
统计学处理：数据分析采用Clamfit及Sigmaplot软件. 数据以x±s表示，两组间比较用SPSS 12.0软件进行t检验. P≤0.05为差异有统计学意义.
2结果
未转染及稳定转染hKv1.5基因的HEK 293细胞上记录的原始电流见图1. 未转染的细胞上只能记录到很小的、随时间减小且无尾电流的背景电流，稳定转染hKv1.5基因的细胞上可记录到一具有明显电压依赖性的、超快激活的外向电流，在-40 mV的复极化刺激下有小但明显的尾电流，与人心房肌细胞IKur类似［8］. 在+40 mV时，未转染的细胞上记录的背景电流及稳定转染hKv1.5基因的细胞上记录的电流幅度分别为（0.15±0.3） nA和（3.20±0.60） nA (n=8，P&<0.01). 二者的电流-电压关系曲线见图2，可见稳定表达的hKv1.5电流的激活电压在-30 mV左右.
图1未转染及稳定转染hKv1.5基因的HEK 293细胞膜电流比较（略）
图2未转染及稳定转染hKv1.5基因HEK 293细胞膜电流-电压关系曲线（略）
3讨论
我们将编码人心房肌IKur通道α亚单位的hKV1.5基因转染HEK 293细胞，通过反复筛选、鉴定，获得了稳定表达hKv1.5通道蛋白的细胞系，初步的研究结果表明此细胞系表达的hKv1.5电流具有与人心房肌IKur相似的电流特征.
体外表达人心肌离子通道基因是研究人心肌离子通道功能、调节的重要手段，以往研究多采用瞬时转染方式，以非洲爪蟾卵母细胞，CHO和COS7细胞等作为心肌离子通道体外表达系统［9］，每次实验前均需进行转染，转染效率不稳定， 实验应用不便， 并且爪蟾卵母细胞和人心肌细胞存在较大的种属差异， 并且瞬时转染系统不适合离子通道调节剂的高通量筛选.
HEK293细胞来源于人胚胎肾上皮细胞，也是常用的人心肌细胞离子通道基因体外表达系统. 研究表明，HEK293细胞无内源性Kv1.5通道mRNA的转录［10］，其细胞膜上无Kv1.5通道表达，作为hKv1.5钾通道体外细胞模型，可以排除内源性Kv1.5电流对实验的干扰，由于HEK293是源于人的细胞系，以其为模型取得的实验结果与人心肌细胞差异会更小. 本研究结果表明，稳定表达的hKv1.5钾通道电流与人心房肌IKur相似：激活电压约-30 mV左右，具有超快激活和延迟整流的特点，因此可以作为体外研究人心房IKur电流的药理特性及其调控机制的细胞模型，特别适用于以Kv1.5为靶点抗心律失常药物的高通量筛选.
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参考文献
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