作者：李源莉 卞干兰 张金萍 陈建宗 陈良为
【Abstract】 AIM: To examine the localization and distribution patterns of neuronkinin4 receptor (NK4R) in neurons of the cerebral cortex of adult mice. METHODS: By using Nissl staining， immunoenzyme histochemistry and double immunofluorescent staining， the distribution patterns of neurons in the layers of cerebral cortex， the localizations of NK4R and neuronal nuclear specific protein (NeuN)， NK4R and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the neurons of cerebral cortex of C57/BL mice were observed， and their distributions were analyzed by semiquantitative method. RESULTS: NK4Rimmunoreactivity was found extensively localized in neuronal somata and neurite of cerebral cortex (layerⅡ， Ⅳ， Ⅵ)， and mainy in layer Ⅲ， Ⅴ. Doublelabeling experiments confirmed that 100% NK4Rimmunoreactive neurons coexpressed NeuN， but not GFAP. CONCLUSION: The localization and distribution of NK4R in the neurons of cerebral cortex of mice suggests that the novel NK4R may be involved in the modulation of neuronal properties and the process of neuronal pathological changes in the cerebral cortex of mammals.
【Keywords】 neurokinins; cerebral cortex; neuron; immunohistochemistry; mice
【摘要】 目的：探讨神经激肽NK4受体（NK4R）在大脑皮层的表达分布特征. 方法：正常成年C57/BL小鼠脑组织冰冻切片，进行Nissl染色，NK4R免疫酶组织化学染色，NK4R/NeuN， NK4R/GFAP免疫荧光双标染色，采用内对照的半定量分析方法研究NK4R在大脑皮层各层的分布表达情况. 结果：NK4R免疫阳性产物在皮层的锥体细胞层分布最多（Ⅲ，Ⅴ层），在皮层内、外颗粒层、多形层（Ⅱ，Ⅳ， Ⅵ层）也广泛分布，其阳性产物表达于神经元胞体和突起上，免疫荧光双标结果观察到NK4R与神经元胞核特异性标记物NeuN共存（100%，146/146，双标细胞数目/NK4R阳性细胞数目），且不与星形胶质细胞标记物GFAP共存. 结论：NK4R免疫阳性产物在大脑皮层神经元的分布表达，提示NK4R可能参与了哺乳类动物大脑皮层神经元功能调节和病变过程.
【关键词】 神经激肽; 大脑皮层; 神经元；免疫组织化学; 小鼠
0引言
神经激肽（neuronkinins， NKs）作为一种神经递质，具有重要的生物学活性，其效应发挥由相应的NKs受体(G蛋白偶联受体)来介导，近年来研究发现NKs及其受体在神经变性性疾病（例如帕金森病，阿尔茨海默病等）中，对于神经元变性凋亡具有一定的干预作用［1］. 神经激肽NK4受体（neuronkinin4 receptor， NK4R）是近年来发现的一种新型神经激肽受体，对于其在中枢神经系统中的定位分布目前报道很少，我们的实验研究采用免疫组织化学染色方法，观察NK4R在小鼠大脑皮层神经元中的表达分布特征，旨在为进一步探讨NK4R在皮层神经元病变中的作用奠定一定的实验基础.
1材料和方法
1.1材料正常成年雄性C57/BL小鼠，体质量20～22 g（第四军医大学实验动物中心提供）;羊抗NK4R mAb (美国Santa Cruz公司);鼠抗NeuN，兔抗GFAP mAb (美国Chemicon公司)；HRP标记的兔抗山羊第二抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）；驴抗山羊IgG： FITC；驴抗鼠IgG，驴抗兔IgG ：TRITC（美国Moleculer Probes公司）.
1.2方法
1.2.1取材，固定及切片小鼠在10 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg，ip)麻醉后，迅速开胸， 经左心室至升主动脉插管 ，先以100 mL生理盐水冲去血液，继用含40 g／L多聚甲醛的0.1 mol／L磷酸缓冲液(PB，pH 7．4)先快后慢灌流固定，灌毕立即取出全脑，将组织放置于含200 g/L 蔗糖的0.1 mol/L磷酸缓冲液中(PB，pH 7．4)，4℃下过夜，至组织沉底， 恒冷箱冰冻切片机切片厚14 μm，切片分为4套.
1.2.2皮层脑片尼氏染色（Nissl染色）切片一套经1 g/L焦油紫染色3～5 mim，蒸馏水洗，950 mL/L乙醇分化至尼氏小体仅呈蓝色，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固.
1.2.3NK4R免疫组织化学染色切片一套于0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7．4)中漂洗3次，以羊抗NK4R mAb（1∶100）室温下孵育16～18 h，抗体稀释液为含有10 g/L牛血清白蛋白(BSA)，30 mL/L正常羊血清和1 mL/L Triton X100的0.01 mol/L PBS，0.01 mol/L PBS漂洗后，用HRP标记兔抗山羊第二抗体（1∶500）室温下孵育2 h，0.01 mol/L PBS漂洗后，加入ABC复合物，室温下孵育2 h，用DAB/h3O2进行呈色反应，室温下反应15～20 min，漂洗后，切片裱在明胶载玻片上，晾干，中性树脂封片.
1.2.4NK4R/NeuN， NK4R/GFAP双标免疫荧光组织化学染色切片二套分别以羊抗NK4R mAb（1∶100）和鼠抗NeuN mAb（1∶2000）混合物，羊抗NK4R mAb（1∶100）和兔抗GFAP mAb（1∶3000）混合物室温下孵育16～18 h， 抗体稀释液同1.2.3. 用0.01 mol/L PBS漂洗后避光，分别用驴抗羊IgG FITC（1∶500），驴抗鼠IgG，抗兔IgG TRITC（1∶500）室温下孵育2 h，漂洗后，切片裱在明胶载玻片上，晾干，甘油封片.
1.2.5图像分析于OlympusBX51显微镜和激光共聚焦显微镜进行图像采集分析.
1.2.6半定量分析用内对照的半定量方法来确定NK4R免疫阳性反应产物在皮层各层的数量以及染色强度，NK4R阳性结构(胞体与突起)的数量，分别用密集，中等，+稀疏，－无；NK4R阳性结构(胞体与突起)的染色强度，强，中等，+弱和－阴性来表示.
2结果
2.1皮层神经细胞构筑在Nissl染色的皮层脑片上可以观察到皮层神经元呈分层排列特征，Nissl染色标记了神经元核及核周斑块（图1）.
2.2NK4R在皮层的分布NK4R免疫阳性神经元广泛分布于皮层Ⅱ~Ⅵ层神经元胞体及突起的膜表面，主要集中在椎体细胞上， NK4R神经元胞体形似棱锥或等腰三角形，直径多在15～80 μm之间，锥体尖朝向皮层表面，含有泡状的大核，自胞体尖顶发出一个尖端树突或主干树突，伸向脑表面（图2）.
A：NK4R免疫阳性神经元在皮层分布表达 SABC ×200； B： NK4R免疫阳性神经元 SABC ×400.
图2NK4R在小鼠大脑皮层神经元上的定位分布（略）
2.3NK4R/NeuN，NK4R/GFAP免疫荧光双重标记NeuN阳性反应物位于神经元胞核，NK4R阳性反应物丰富分布于胞体及突起的膜表面，NK4R阳性细胞与神经细胞核标记物NeuN共存（100%，double/NK4R，146/146); 星形胶质细胞标记物GFAP主要存在于皮层表层，分布于神经元胞体和突起周围，不与NK4R共存（图3）.
2.4半定量分析结果半定量统计结果显示NK4R免疫阳性神经元主要集中在锥体细胞层，在皮层的Ⅲ，Ⅴ层数量密集()，染色强度也最强()；在外颗粒层、内颗粒层、多形层（Ⅱ，Ⅳ，Ⅵ层）数量中等()，染色强度弱(+)；在分子层（Ⅰ层）数量无(-)，染色强度为阴性(-).
A: NeuN标记； B: NK4R阳性细胞； C: NK4R与NeuN的双标； D: GFAP标记； E: NK4R阳性细胞； F: NK4R与GFAP的双标.
图3NK4R免疫阳性物与NeuN及GFAP在皮层神经元的双标染色免疫荧光 ×200（略）
3讨论
NKs受体在中枢神经系统分布广泛，多项研究表明其在神经元保护、信号转导及调节凋亡等方面具有重要作用［2］. 神经激肽NK1/NK3受体(Neurokinin1/3 receptor， NK1R， NK3R)已发现在大脑皮质的浅层、梨状皮质、背侧海马、杏仁核、脑干网状结构等核团内均含有一定数量的阳性神经元［3］. 研究发现NK4R与NK3R的结构相似［4］，目前对于NK4R在中枢神经系统中的分布以及功能活性尚不十分清楚，Donaldson等［5］通过Northern blot发现NK4R mRNA 在大鼠大脑皮层、海马、下丘脑有表达. 我们采用免疫组织化学染色方法观察到NK4R在小鼠大脑皮层（Ⅱ～Ⅵ）神经元上均有表达，提示其在皮层病变中具有一定的调节作用，从形态学角度观察到了NK4R免疫阳性产物在皮层的分布特征，为继续探讨NK4R功能及参与皮层神经元病变等研究提供了实验依据.
研究表明，NK1R拮抗剂对甲基苯丙胺所引起的黑质纹状体多巴胺神经元损伤、变性、凋亡等病理性改变具有抑制作用［6］.
皮层神经元大量损伤变性死亡与老年痴呆的发病之间存在密切联系，NK4R在皮层神经元的丰富分布，提示其可能在痴呆的干预研究方面具有一定的价值. Chen等［7］研究发现NKs受体与谷氨酸（Glu）受体NMDA和AMPA在中枢神经系统一些区域神经元上共存，提示了NKs受体阻滞剂可能是通过抑制Glu兴奋性毒性的途径来在实现其神经保护作用的. 随着痴呆人数的逐年增长，以及越来越多NKs受体功能新的研究进展的报道，NK4R在大脑皮层的表达分布，亦为我们进一步探讨其在皮层神经元病变，特别是老年痴呆以及机制研究奠定料基础.
【
参考文献
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［3］ 王红， 张远强， 丁玉强， 等. 神经激肽B受体在小鼠中枢神经系统内的定位分布［J］. 解剖学报， 2002， 33( 1) :22-26.
［4］ Sarau HM， Mooney JL， Schmidt DB， et al. Evidence That the proposed novel human “Neurokinin4” receptor is pharmacologically similar to the human Neurokinin3 receptor but is not of human origin［J］. Mol Pharmacol， 2000，58: 552-559.
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