作者：龙友国 余跃生 苏晓庆 张小蕾 戎聚全 龙思方 罗载刚 郭光武
【关键词】 荔波水族；短串联重复序列；PCR；遗传多态性；聚类分析
【Abstract 】 AIM: To investigate the genetic polymorphism of CSF1PO， TPOX and TH01 STR loci in Libo Shui population in Guizhou province. METHODS: Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the EDTAblood specimens collected from 97 unrelated Shui inpiduals in Shuiyao town， Libo County， Guizhou province. The PCR products were classified through denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining to get genotype and gene frequency， as well as heterozygosity (H)， polymorphism information content (PIC)， discrimination power (DP) and probabilities of paternity exclusion (PPE). Gene frequency of CSF1PO， TPOX and TH01 STR loci in Libo Shui population and in other 6 minority populations was analyzed by fuzzy grouping analysis. RESULTS: 6， 5， 5 alleles and 15， 12， 13 genotypes were observed at CSF1PO， TPOX and TH01 respectively. The distribution of genotype of all the 3 loci met HardyWeinberg equilibrium (P&>0.05). The H of CSF1PO， TPOX and TH01 were 0.7287， 0.5423， and 0.6904， PIC 0.6652， 0.4880， and 0.6806， DP 0.8782， 0.7361 and 0.8563， PPE 0.6148， 0.3646， and 0.5737 respectively. CONCLUSION: CSF1PO and TH01 are of greater genetic polymorphism in Libo Shui population than TPOX， which indicates that the genetic relationship between Libo Shui population and other 6 minority populations in southwestern China is consistent with the result of ethnology investigation.
【Keywords】 Libo Shui population; short tandem repeat; polymerase chain reaction; genetic polymorphism; cluster analysis
【摘要】 目的：调查贵州荔波水族人群CSF1PO，TPOX和TH01 STR基因座的遗传多态性. 方法：采集贵州省荔波县水尧水族乡97名水族无关个体EDTA抗凝血标本，Chelex100法提取DNA， PCR进行扩增，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染方法进行分型，获取CSF1PO，TPOX和TH01 STR基因座的基因型，基因频率及杂合度(H)，多态信息量(PIC），个体识别率(DP)和非父排除率(PPE)等法医学相关数据，并利用该人群这3个STR基因座的基因频率与文献报道的广西侗族等南方其他6个民族群体相同基因座的基因频率进行聚类分析. 结果：贵州荔波水族人群CSF1PO，TPOX和TH01 STR基因座分别检出等位基因6，5和5个，基因型分别为15，12和13个，各基因座基因型分布均符合HardyWeinberg平衡定律（P&>0.05）. 三个基因座的H分别为0.7287，0.5423，0.6904；PIC分别为0.6652，0.4880和0.6806； DP为0.8782，0.7361和0.8563；PPE为0.6148，0.3646和0.5737. 结论：CSF1PO和TH01基因座在贵州荔波水族人群中有较高的遗传多态性，该人群与广西侗族等6民族群体间的遗传关系和民族学研究的结果基本吻合.
【关键词】 荔波水族；短串联重复序列；PCR；遗传多态性；聚类分析
0引言
短串联重复序列（short tandem repeat， STR），又称为微卫星DNA（microsatellite DNA）. 其重复单位较简单，又称为简单重复序列（simple repeat sequences， SRS; simple sequences of repeats，SSR）. STR的等位基因片段长度一般在100~500 bp以内，由于重复数目的次数不同而显现出高度的遗传多态性［1］. STR广泛应用于基因作图、基因诊断、器官移植、人类学、群体遗传学、法医个体识别、亲权鉴定［2］以及民族学和考古学等领域［3］. 水族主要分布在贵州省三都水族自治县和荔波、独山等县市. 近年来，余跃生等［4］开展了贵州三都水族人群线粒体序列多态性研究，何燕等［5］也对该地区水族Y染色体单倍型频率作了调查和覃筱燕等［6］对同地区同民族的ABO血型基因频率分布作了分析，而对荔波水族的相关研究，特别是其常染色体STR基因座遗传多态性方面的研究尚未见报道.
我们选择常染色体上CSF1PO，TPOX和TH01三个STR基因座进行研究，旨在获得贵州荔波水族人群的基因型、基因频率和法医学相关数据，为该人群的群体遗传学和法医学研究提供基础资料，并通过聚类分析探索贵州荔波水族和南方其他6个民族群体的遗传关系.
1对象和方法
1.1对象贵州省荔波县水尧水族乡水族无关个体EDTA抗凝血标本97份以及文献［7-11］提供的贵州汉族、广西瑶族、广西壮族、广西水族、广西毛南族和广西侗族CSF1PO，TPOX和TH01基因座的基因频率资料.
1.2方法用Chelex100方法提取DNA. PCR反应总体积为25 μL，其中STR 10×buffer 2.5 μL，STR 10×primer pairs 2.5 μL，纯水15 μL，Taq酶2 μL (相当于1 U)，模板3 μL. 扩增条件为96℃预变性2 min，94℃ 1 min，64℃ 1 min，70℃ 1.5 min，循环10次；90℃ 1 min，64℃ 1 min，70℃ 1.5 min，循环20次，4℃保存. PCR扩增产物3 μL和3.5 μL 2×loading buffer混匀，DNA ladder 3 μL和3.5 μL 2×loading buffer混匀，95℃预变性2 min，电压2000 V，功率50 W，电流25 mA，电泳90 min.
统计学处理： 对每个样品逐个分型，并记录其基因型，计算基因频率，再对各基因座的基因型分布作χ2检验. 杂合度、多态信息量、个体识别率和非父排除率由相关公式计算［1，12］. SPSS13.0统计软件包处理该7个民族群体的等位基因频率，各群体间计算采用欧氏遗传距离法. 通过系统聚类方法对各群体进行聚类分析，类间相似系数计算采用平均法，并输出聚类分析图.
2结果
97名贵州荔波水族无关个体CSF1PO， TPOX和TH01STR基因座基因型、基因频率（表1），法医学相关数据（表2），贵州荔波水族人群与南方其他6个民族群体聚类不同（图1）.
表1贵州荔波水族CSF1PO，TPOX和TH01 基因座等位基因频率和基因型分布（略）
注：HardyWeinberg平衡检验. a：χ2＝13.24， df=9， P＞0.05； b： χ2=5.76，df=6，P＞0.05；c：χ2＝6.33，df=8，P＞0.05.
图1贵州荔波水族人群和南方其他6个民族群体的聚类图（略）
3讨论
我们对贵州荔波水族人群CSF1PO， TPOX和TH01三个基因座进行复合扩增，共检出等位基因片段16个，基因型40个.其中CSF1PO基因座的等位基因片段6个，基因型15个， 等位基因频率在0.0122~0.3658之间，A10，11，12为高频等位基因，A12的等位基因频率为最高. TPOX基因座的等位基因片段5个，基因型12个，等位基因频率在0.0609~0.6463之间，A8的基因频率最高，A8和A11为高频等位基因. TH01基因座的等位基因片段5个，基因型13个，等位基因频率在0.0854~0.3719之间，A9的等位基因频率最高， A7和A9为高频等位基因，这与黄飞骏等［13］报道的中国人以TH01中A7和A9频率最高相吻合. 各基因型分布符合HardyWeinberg平衡定律.
一般认为杂合率能客观的反映出群体的遗传变异水平，当H＞0.7时［14］，群体内部的变异越大，就属于高度多态性的标记. 多态信息量（PIC）它直接反映出一个遗传标记所包含或所能提供的遗传信息容量，当PIC＞0.5时，标记具有高度的可提供信息性；0.5＞PIC＞0.25时，标记能够较合理地提供信息；而当PIC＜0.25时，标记可提供的信息性较差；个体识别率(DP)和非父排除率（PPE）则反映了该遗传标记在法医学个体识别及亲权判定中的能力. 当DP＞0.8，PPE＞0.5时，属于高度多态性标记，具有较高的应用价值［15］. 贵州荔波水族人群 CSF1PO，TPOX和TH01基因座中除TPOX外， CSF1PO和TH01基因座在贵州荔波水族人群中有高度的多态性，所得数据在该民族群体遗传学和法医个体识别等研究中具有较高的应用价值. 我们的研究结果还显示：贵州荔波水族、广西侗族、广西水族与广西毛南族间的遗传关系较近，在聚类图上聚为一大类；而贵州汉族，广西瑶族，广西壮族各为一类.
民族学研究［16］认为，水族、侗族、毛南族三个民族的语言同属汉藏语系壮侗语族侗水语支，都起源于古代“百越”民族，在族源上有渊源关系. 水语与同语族中的毛南语、侗语、布依语和壮语有亲缘关系，尤其与毛南语、侗语的关系更为密切［17］. 另外，我们研究的贵州荔波水族、广西侗族、水族和毛南族四个民族都来自黔桂边境，地域分布相接近，其同聚为一大类，提示基因频率分布特征与其地理位置呈平行关系.
致谢在标本采集过程中得到贵州荔波县水尧水族乡卫生院吴宇儒院长和县计生局蒙生勇同志的大力支持，实验部分得到宁夏自治区公安厅法医DNA实验室王华主任和李敏老师的热情帮助.
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