【关键词】 PEG10基因；RNA干扰；表达载体
【Abstract】 AIM: To construct the siRNA eukaryotic expression vectors of PEG10 gene and to investigate their apoptosisinducing effect on transfected HepG2 cells in vitro. METHODS: Three specific siRNAs of PEG10 were designed， and cloned into the psiRNAhH1neo， which were transiently transfected into HepG2 via Lipofectamine 2000. Realtime quantitative PCR was used to measure the PEG10 mRNA expression in HepG2. The cell growth was assessed by MTT assay and the apoptosis was evaluated by flow cytometry and confocal microscopy. RESULTS: Three specific siRNA eukaryotic expression vectors (siRNA1， siRNA2， siRNA3) targeting PEG10 were successfully produced， which could inhibit the expression of PEG10 mRNA to varying degrees. The expression of PEG10 mRNA was remarkably inhibited at 48 h after transfection， and siRNA2 resulted in the highest inhibition rate (93.99%). HepG2 growth was also inhibited significantly (P&<0.05)， and cell apoptosis rate reached the highest after siRNA2 transfection (66.91%). CONCLUSION: SiRNA eukaryotic expression vectors targeting PEG10 gene can induce HepG2 cell growth inhibition and apoptosis through downregulating PEG10.
【Keywords】 PEG10 gene; RNA interference; eukaryotic expression vector
【摘要】 目的：构建针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体，体外观察其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响. 方法：设计针对PEG10基因的3个siRNA靶序列，构建真核表达载体siRNA1，siRNA2和siRNA3，脂质体分别转染HepG2细胞后实时定量PCR，检测其对HepG2细胞PEG10基因表达的影响，MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染siRNA后的HepG2细胞的生长活性及凋亡. 结果：成功构建了针对PEG10基因的3个特异性siRNA表达载体. 它们不同程度地抑制了HepG2细胞PEG10基因的表达，以siRNA2抑制效率最高，可达93.99％. HepG2细胞的生长也明显受到抑制（P&<0.05），大量HepG2细胞凋亡，siRNA2凋亡率最高，为66.91%. 结论：靶向PEG10基因的siRNA表达载体可抑制肝癌HepG2细胞的生长，诱导细胞凋亡，该作用与降低PEG10基因的表达有关.
【关键词】 PEG10基因；RNA干扰；表达载体
0引言
PEG10（paternally expressed gene 10）是在肝细胞癌组织中发现的一个新的遗传印记基因［1］，属于父方表达的印记基因［2-3］，以往的研究［4-6］显示此类印记基因的过表达可导致细胞的恶性转化. 本研究室的前期研究［7］发现，PEG10基因在肝癌组织中异常表达，且特异性比甲胎蛋白（AFP）更高. 故PEG10基因的高表达与肝癌发生关系密切，干扰其表达可能成为肝癌治疗的新手段. 我们拟采用RNAi技术，构建针对PEG10的siRNA真核表达载体，转染肝癌细胞HepG2，观察其抑制PEG10基因的表达及其对肝癌细胞生长和凋亡的影响，为其应用于肝癌治疗奠定基础.
1材料和方法
1.1材料人肝癌细胞株HepG2和大肠杆菌DH5α由本实验室保存. 质粒psiRNAhH1neo（美国InvivoGen公司）；限制性内切酶BbsⅠ和T4 DNA连接酶（美国NEB公司）；MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq聚合酶（美国Promega公司）；optiMEM和转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；高纯质粒提取试剂盒（杭州Vgene公司）；DNA凝胶回收试剂盒（上海华舜生物工程公司）；人Annexin VFITC试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）. FACSort流式细胞仪（Bacton Dickinson公司）；FV500共聚焦显微镜（Olympus公司）；Multiskan Mk3酶标仪（Thermo Labsystems公司）.
1.2方法
1.2.1siRNA靶序列的设计利用GenBank检索PEG10 mRNA（录入号：AB049834）全长序列，遵循siRNA的设计原则，通过Invivogen公司提供的siRNA Wizard在线软件筛选出3条21nt的序列. 即siRNA1： 5′ GCAGAAGCTCACAGAGGAGAA 3′；siRNA2：5′ GCACAACTACCCAGCTTTCAT 3′；siRNA3： 5′ GTTCGATGGCAACCCAGACAT 3′. 同时设计出非特异性靶序列：5′ GATTCCATTAGACATCACACA 3′. 两端引入BbsⅠ酶切位点，由上海生工生物工程公司合成.
1.2.2靶向PEG10的siRNA真核表达载体的构建将化学合成的正义链和反义链退火，形成shRNA表达模板，与经BbsⅠ酶切后线性化的psiRNAhH1neo载体连接，将连接产物转化到用氯化钙法制备的感受态DH5α中，收集转化后菌落，涂布在含卡那霉素的LB培养板上，37℃倒置培养12～16 h，蓝白斑筛选，挑选白色阳性单克隆. 37℃摇菌12～14 h，提取质粒，由上海英骏生物技术公司进行测序鉴定.
图1靶向PEG10的siRNA真核表达载体的构建（略）
1.2.3细胞转染转染前1日取对数生长期的HepG2细胞，以3×105/孔接种于6孔板，细胞融合达40％～60％时转染. 转染方法按照脂质体Lipofectamine2000说明书进行. 根据是否进行质粒转染和转染质粒的不同分为6组. 即空白对照组(不进行转染的同期培养的HepG2细胞)，空质粒组(转染psiRNAhH1neo空质粒)，siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组(分别转染3个重组质粒siRNA1，siRNA2和siRNA3)，非特异性siRNA组(转染重组的非特异性siRNA质粒).
1．2．4实时定量PCR检测PEG10表达将重组质粒和空质粒分别转染HepG2细胞并培养48 h后用Trizol试剂提取各组1×107细胞总RNA，逆转录成cDNA第1链，然后以cDNA为模板，分别对PEG10基因及βactin进行Realtime PCR反应，反应体系为：cDNA 1 μL，20 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，dNTP混合液3 μL，Taq DNA聚合酶3 U，MgCl2溶液3 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，SYBR Green I 6.25 μL，去离子水补至25 μL. PCR扩增条件94℃变性5 min，35个PCR循环（94℃ 20 s；58℃ 20 s；72℃ 20 s），72℃延伸5 min，75℃时检测荧光信号，绘制标准曲线. 引物序列：PEG10，上游: 5′ CCAAGTCGCTGTCTGCTCTGA 3′，下游: 5′ GCGTAGTGACCTCCTGTTCCA 3′；βactin，上游: 5′ CCTGTACGCCAACACAGTGC 3′，下游: 5′ ATACTCCTGCTTGCTGATCC 3′. 根据绘制的标准曲线得到PEG10基因及βactin表达的相对浓度，以PEG10基因与βactin相对浓度的比值来反映PEG10表达量. 每个样品做2个平行管，实验重复3次. 使用RotorGene 6.0分析软件对实验结果进行分析. PEG10表达抑制率(%)=（1-转染组PEG10表达量/对照组PEG10表达量）×100％.
1.2.5MTT法检测细胞增殖取对数生长期HepG2细胞，转染前1日以1×104/孔接种96孔板，将重组质粒和空质粒分别转染细胞中，继续培养24，48，72，96，120 h后分别加入5 g/L MTT 20 μL，37℃避光孵育4 h，弃去培养基，加入100 μL DMSO，避光30 min，待其完全溶解后，用酶标仪测定A490 nm值. 以空质粒转染组作为阴性对照，实验重复3次，细胞生长抑制率(%)＝（1-转染组吸光度值/对照组吸光度值）×100％.
1.2.6流式细胞仪检测凋亡率收集转染48 h的HepG2细胞，PBS洗涤并重悬细胞，750 mL/L冰乙醇固定1 h，PBS冲洗后加入终浓度为50 mg/L的碘化吡啶(PI)和终浓度为100 mg/L的RNaseA，避光30 min后，上机检测.
1.2.7共聚焦显微镜检测将PBS洗涤转染48 h的HepG2细胞，加入250 μL结合缓冲液，再加入5 μL Annexin V/FITC，混匀后于室温避光孵育10～15 min，加入20 mg/L的PI 10 μL，室温避光孵育5～10 min，在共聚焦显微镜下观察并拍照.
统计学分析：采用SPSS 11.0统计软件包进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P&<0.05表示差异有统计学意义.
2结果
2．2siRNA表达载体对PEG10基因mRNA的抑制作用实时定量PCR结果显示，未转染组、空质粒组和非特异性siRNA组的PEG10基因高表达，siRNA1，siRNA2和siRNA3组的PEG10基因表达明显受到抑制（P&<0.05）. siRNA2组PEG10的表达抑制最明显(图2).
aP&<0.05 vs空白对照组.
图2实时定量PCR检测PEG10基因表达水平（略）
2．3siRNA对HepG2细胞增殖的抑制siRNA1，siRNA2和siRNA3组对HepG2细胞生长均有显著的抑制作用（P&<0.05）. 转染后96 h，细胞生长的抑制作用达到平台期，并持续到转染后120 h（图3）. siRNA2组作用最明显.
aP&<0.05 vs非特异性siRNA组.
图3siRNA对HepG2细胞生长的影响（略）
2．4siRNA诱导HepG2细胞凋亡转染后48 h， siRNA2组的细胞凋亡率为66.91%，明显高于其他组（图4）.
A：空白对照组； B：空质粒组； C：非特异性siRNA组； D：siRNA1组； E：siRNA2组； F：siRNA3组； M1：凋亡细胞百分率.
图4转染后48 h流式细胞仪检测细胞凋亡率（略）
2．5凋亡细胞形态学激光共聚焦显微镜显示，凋亡细胞的细胞膜被AnnexinⅤFITC标记，镜下呈绿色荧光，早期凋亡细胞的细胞膜不被PI着色；晚期凋亡细胞或坏死细胞同时被AnnexinⅤFITC和PI标记；活细胞两种荧光均无标记（图5）.
A：绿色荧光检测；B：红色荧光检测；C：双荧光检测.
图5siRNA2对HepG2细胞凋亡的影响（略）
3讨论
RNAi技术是近年来涌现出的一种有效的基因沉默手段，能高效、特异地抑制细胞内基因地表达，其发挥作用的关键是siRNA靶位点的选择和制备. 我们选择表达载体法，与目前常用的其他制备siRNA的方法如化学合成法、体外转录法、“鸡尾酒法”和表达框法等相比，既经济高效又可以进行长期稳定的研究. 我们采用的psiRNAhH1neo载体，其H1启动子是RNA聚合酶Ⅲ启动子，它能够高效特异的转录出small hairpin RNA（shRNA，47nt），进而在体内被切割成siRNA（21nt），大大提高了RNAi的效率和特异性. 我们设计合成的3个特异性siRNA真核表达载体，转染肝癌HepG2细胞后，实时定量PCR结果证实PEG10的表达均显著下调，表明选择的靶位点是有效的，构建的siRNA真核表达载体可以成功地抑制肝癌细胞中PEG10的表达. 其中siRNA2组的效果最为突出，提示siRNA2可能是靶向PEG10的最有效的靶序列之一，可以用于我们的后续实验.
肿瘤的发生发展与基因的异常表达关系密切，遗传印记基因的改变对肿瘤发生的影响已引起人们的关注. 目前已有研究提示肝癌的发生存在着遗传印记基因的异常表达［8］. Tsou等［9］发现遗传印记基因PEG10基因在肝癌细胞中高表达，而在正常人的肝、胰、结肠、胃、淋巴细胞和表皮细胞中无表达. 我们运用RNAi技术，靶向干扰PEG10基因的表达. 结果显示，转染靶向PEG10的特异性siRNA真核表达载体能明显抑制肝癌细胞的生长，诱导肝癌细胞凋亡. 故本研究也证实了PEG10基因的过表达与肝癌的发生密切相关，阻断PEG10基因的表达可望成为治疗肝癌的有效手段.
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