免疫细胞化学和形态学定量浅析鉴别胸腹水良恶细胞的意义

【摘要】 目的: 探讨免疫细胞化学和形态学分析在胸腹水细胞学鉴别诊断中的意义. 方法: 良恶性胸腹水各30例，应用免疫细胞化学SP法检测癌胚抗原（CEA）、上皮膜抗原（EMA）、波形蛋白（vimentin）的表达，并应用计算机图像分析系统定量测定其脱落细胞的核面积、浆面积、核浆比、细胞周长、平均直径、圆度和形状因子. 结果: 恶性胸腹水中腺癌细胞（B组）CEA表达均阳性，EMA部分阳性，vimentin均阴性；增生性间皮细胞（A组）EMA和vimentin部分阳性，CEA均阴性. 腺癌细胞的核面积、浆面积、核浆比、细胞周长、平均直径和形状因子高于增生性间皮细胞（P&<0.05）， 两组间细胞圆度无统计学差异（P&>0.05）. 结论: 免疫细胞化学在良恶性胸腹水鉴别诊断中有重要作用， 形态学定量分析可提供参考， 二者综合分析是提高胸腹水细胞学阳性诊断率的有效途径之一.
【关键词】 免疫细胞化学 形态学分析 腹水 腺肿瘤 胸腔积液
　　0　引言
　　胸腹腔积液是常见的临床征象，病因复杂. 对积液进行脱落细胞学检查，可以判定疾病的性质，但普通染色片有时对高分化腺癌和增生性间皮细胞不易鉴别. 应用免疫细胞化学对积液中脱落细胞进行标记，并结合细胞形态学定量分析，在二者鉴别诊断中有较高的应用价值［1-2］. 我们对我院近年来良恶性胸腹水各30例采用免疫细胞化学SP法标记和计算机形态学定量分析，探讨免疫细胞化学和形态学观察在胸腹腔积液细胞学诊断和鉴别诊断中的意义.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　良性组(A组)30例，其中18例结核性胸水，胸部CT检查诊断为结核，痰中结核杆菌阳性;12例肝硬化腹水，腹部B超诊断为肝硬化，肝功谷草转氨酶升高，乙肝系列表面抗原阳性.男15例，女15例，年龄18~71（平均45.4）岁.恶性组(B组)30例，其中15例血性胸水，支气管镜或胸膜活检病理证实为肺腺癌;15例腹水，胃镜或B超诊断为胃癌或卵巢癌.男21例，女9例，年龄39~79（平均59.7）岁.
　　1.2方法
　　新鲜胸腹水沉淀5 min后，留取沉淀部分约10 mL，在自动涂片离心机(日本樱花精密机械有限公司产品)离心10 min (2100 r/min)，弃上清液，将沉淀在载玻片上的细胞均匀涂在常规HE染色的玻片，每例一张，在抹有APES载玻片上涂片，每例3张，稍干后，一张常规涂片放入950 mL/L乙醇中固定15 min，HE染色. 对其所示细胞在CMIAS真彩色病理图像分析系统(北京航天大学图像中心与空军总医院图像开发组产品，CMIAS型，WINDOW98软件)下测细胞核、浆的面积，核浆比例，细胞周长，平均直径，圆度，形状因子.置于40倍镜下观察，选择细胞密集重叠较少的区域采图，分割，编辑，统计，获得脱落细胞形态学原始数据. 对重叠细胞、红细胞或淋巴细胞予以弃除. 在同一制片、同种染色及光照条件下，每例测定分析细胞50个，校正因子1.1. 抹有APES的涂片稍干后，即放入乙醚乙醇液(1∶1)中固定15 min，水洗. 固定后的涂片先用蒸馏水冲洗，再用PBS冲洗3次后，滴加A液(50 mL/L正常羊血清)适量，在室温、湿盒内各封闭10 min，37℃孵育1 h，PBS冲洗，每次5 min，再依次滴加BC液(二抗及SP液)，室温放置30 min. 免疫细胞化学染色采用SP法，一抗及其工作浓度分别为CEA(1∶350)，EMA (1∶150)，vimentin(1∶40)(均购自北京中山生物技术公司). PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性胸腹水涂片作阳性对照. 结果按照每张涂片的阳性细胞比例及着色深浅计分进行判定分析. 阳性细胞所占比例判断，无着色0分，1/3以下着色为1分，1/3~2/3为2分，2/3以上为3分. 阳性强度，无着色0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分. 2项相乘0分为-，1~3分为+，4~6分为2+，7~9分为3+；将-视为阴性、+视为弱阳性、2+视为阳性、3+视为强阳性.
　　统计学处理：数据用x±s表示，计数资料组间比较采用χ2检验，计量组间比较采用t检验，所有统计学分析均用SPSS8.0软件完成.
　　2结果
　　A组涂片中以增生性间皮细胞和淋巴细胞为主，间皮细胞单个散在或成片排列，大小略不一致，细胞核呈圆或卵圆形、多居中，核膜清楚，染色质匀细，有小核仁，胞质丰富，淡伊红色. B组涂片，癌细胞呈团、腺样、乳头样或散在（图1），细胞大小不一，互相拥挤，核大，大小形状不一致，核膜厚，染色质粗且分布不均匀，核仁明显，胞质较少，内可见空泡. 可有病理性核分裂像. 免疫细胞化学染色结果A，B两组有差别（图2，3，表1）， A，B两组细胞形态学定量分析测定结果也有差别（表2）.表1良性和恶性两组免疫细胞化学SP法阳性表达（略）表2良性和恶性两组细胞形态学定量分析(略)
　　3讨论
　　癌胚抗原（CEA）是一组酸性糖蛋白. 广泛存在于各种上皮源性肿瘤，尤其是各种腺癌细胞中表达阳性，体腔间皮细胞中不含CEA，因而是鉴别腺癌和增生性间皮细胞的重要生物学标记物［3-4］. 上皮膜抗原（EMA）在腺癌中呈阳性表达，间皮细胞呈弱阳性可配合其他指标鉴别诊断. 波形蛋白（vimentin）是间叶源性肿瘤标记物，绝大多数上皮源性肿瘤为阴性表达，间皮细胞为阳性. 因而可区分腺癌与增生性间皮细胞. 我们的实验结果与文献报告一致［5］. 说明选用一组组织特异性抗体进行免疫细胞化学表达，在胸腹水中腺癌细胞和增生性间皮细胞鉴别诊断方面有重要作用. 新近研究认为［6］，CEA蛋白在胸腹水鉴别诊断的价值有差异，对良、恶性胸水鉴别有重要价值，而对良、恶性腹水鉴别价值较低. 其中原因可能有：①恶性腹水多由肝癌、卵巢癌等引起，而CEA在这些肿瘤中表达较低. ②部分恶性腹水是因静脉或淋巴回流受阻以及肿瘤而引起的低蛋白血症，而无肿瘤细胞浸润腹腔. 本文B组15例恶性胸水和15例恶性腹水中癌细胞对CEA表达均为阳性，其阳性率高于文献报道［5-6］，可能因观察例数较少. vimentin在间皮细胞中表达率较低，可能与离心等对细胞质影响有关. EMA在腺癌中呈阳性表达，而间皮细胞则为弱阳性，因此，免疫细胞化学用于良、恶性胸腹水的鉴别诊断，提高了阳性诊断率.

　　传统细胞学诊断主要依据细胞的大小、形态、结构、细胞的产物（如粘液）等. 恶性细胞有细胞核的改变（如核增大、深染、核浆比失调，染色质分布不均匀等），细胞互相拥挤等. 有一定的主观性. 信息技术的发展为细胞学诊断的数字化客观评价提供了可能. 本研究以胸腹水中脱落细胞为对象，定量测定其中细胞的核面积、浆面积、核浆比、细胞周长、平均直径和形状因子，发现恶性胸腹水中腺癌细胞明显高于良性胸腹水中的增生性间皮细胞，具有统计学意义(P&<0.05). 结果与徐炜［2］报告的一致. 证实细胞形态学定量分析在鉴别良恶性胸腹水中有一定的作用，快速、可行，客观性强，同时为形态学定量分析提供科学的实验依据. 两组胸腹水中细胞的圆度无显著性差异(P&>0.05)，可能与图像预处理(如分割等)，灰度等原因有关.由于高分化腺癌与增生性间皮细胞的形态学参数阈值缺乏统一标准，尚待进一步研究，因此，图像分析对良恶性胸腹水的鉴别仅提供参考，仍需结合光镜下细胞的形态特点和免疫细胞化学结果. 总之，免疫细胞化学在良恶性胸腹水鉴别诊断中有重要价值，形态学定量分析可提供参考，二者综合分析对鉴别腺癌和增生性间皮细胞具有重要作用，是提高胸腹水阳性诊断率的有效途径之一.

【参考文献】
　　［1］Gong Y， Sun X， Michael CW， et al.Immunocytochemistry of serous effusion speeimens: A comparison of Thinprep vs cell block［J］.Diagn Cytopathol，2003，28(1):1-5.

　　［2］徐炜. 形态学定量分析在胸腔积液诊断中的应用价值［J］.诊断病理学杂志，2002，9(5):311-312.

　　［3］免疫组织化学方法在良恶性胸腹水鉴别诊断中的意义［J］. 实用医学杂志，2004，4(20):374-375.

　　［4］Villena V， LopezEncuentra A， EchaveSustaeta J，et al.Diagnostic value of CA549 in pleural fluid.Comparison with CEA， CA15.3 and CA72.4［J］. Lung Cancer，2003，40(3):289-294.

　　［5］Annika D，Anders H. The Combination of CEA， EMA， and BerEp4 and Hyaluronan Analysis specifically identifies 79% of all histologically verified mesotheliomas causing an effusion［J］.Diagn Cytopathol，2005，32(3):160-166.

　　［6］陈杰，张雪华，张行，等. CEA mRNA、CEA蛋白检测在良恶性胸腹水中鉴别诊断的价值［J］.中国实验诊断学，2003，7(2):97-99.