关于良性胆管狭窄组织中TGFβ1及TβRⅠ的表达意义

【摘要】 目的：研究转化生长因子β1（TGFβ1）、转化生长因子βⅠ型受体（TβRⅠ）在良性狭窄胆管组织中的表达，探讨其信号转导在良性胆管狭窄形成机制中的作用. 方法：采用免疫组织化学SABC法检测TGFβ1，TβRⅠ在23例良性狭窄胆管组织、6例正常胆管组织中的表达. 结果：TGFβ1，TβRⅠ在狭窄胆管组织中的阳性率分别为91.3%，82.6%，在正常胆管组织中的阳性率分别为33.3%，16.7%，组间有明显差异（P&<0.05）. 结论：良性胆管狭窄组织中TGFβ1，TβRⅠ的高表达是造成成纤维细胞增殖旺盛，细胞外基质过度沉积，瘢痕增生的重要因素.
【关键词】 胆管狭窄 TGFβ1；TβR 免疫组织化学
　　0引言
　　良性胆管狭窄是胆道外科复杂的病变与并发症，多由胆管损伤、肝胆管结石和胆管炎反复发作所致. 由于后果的严重性和治疗上的困难，一直是腹部外科的重要问题. 胆管损伤愈合过程突出表现为瘢痕性挛缩并造成管腔狭窄［1］，尤以肝门部或肝门部以上胆管狭窄为著. 转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGFβ1）是目前已知与瘢痕形成关系最密切、最有代表性的生长因子，与瘢痕的发生发展密切相关，而且也影响瘢痕挛缩［2-3］. 为明确TGFβ1信号转导在良性胆管狭窄形成机制中的作用，使用免疫组化方法研究TGFβ1及其受体TβRⅠ在狭窄胆管中的表达如下.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　200306/200511手术病理确诊的良性胆管狭窄患者标本23例，其中损伤及损伤修复术后狭窄17例，肝胆管结石3例，炎性狭窄3例，平均病程（或距前次胆道手术时间）16 mo；男10例，女13例，平均年龄50岁；均经胆肠吻合术治疗出院，平均住院时间22 d. 6例正常胆管组织取自肝移植术中供体胆管. 全部标本经40 g/L甲醛固定，常规石蜡包埋后5 μm厚连续切片. 兔抗人TGFβ1（工作浓度1∶400）， TβRⅠ（工作浓度1∶400）多克隆抗体及SABC试剂盒均购自武汉博士德公司.
　　1.2方法
　　免疫组织化学SABC法，严格按照试剂盒说明操作. 主要步骤：切片常规脱蜡至水；h3O2灭活内源性过氧化物酶；微波修复抗原；正常山羊血清封闭；分别滴加多克隆兔抗人抗体，4℃过夜；滴加生物素化二抗及SABC复合液；DAB显色；苏木素复染；脱水，透明，封片. 用已知TGFβ1及TβRⅠ的阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照. 排除非特异性染色的前提下，以胞质内出现黄色、棕黄色、浅褐色颗粒为阳性标记. 在高倍镜下随机选取10个视野，计数100个细胞，将阳性细胞所占的百分数：≤5%，5%~35%，36%~65%，≥66%分别评分为0，1，2，3分；根据细胞内出现黄色的深浅将无显色、淡黄色、桔黄色、棕黄色分别评分为0，1，2，3分；将二者评分相加除以2，作为该切片的最终评分，将0，1，1.5~2，2.5~3分别评分为（-）（+）（）（）.
　　统计学处理：全部数据使用SPSS11.0统计软件进行分析. 率的比较采用Fisher确切概率法，检验水准：α=0.05；相关关系采用秩相关分析.
　　2结果
　　TGFβ1和TβRⅠ的免疫反应产物均定位于细胞质，主要表达于肉芽组织、成纤维细胞、纤维细胞、血管内皮细胞及巨噬细胞（图1A，B）；正常对照组可见胆管上皮、血管内皮及管壁纤维细胞胞质内表达（图1C）. 病例组TGFβ1和TβRⅠ阳性率分别为91.3%和82.6%，对照组中二者的阳性率分别为33.3%和16.7%，在狭窄胆管组的阳性率明显高于正常胆管组（P&<0.05）；TGFβ1和TβRⅠ在病例组表达阳性率的差别无显著性意义（P&>0.05，表1）；TGFβ1和TβRⅠ在病例组的表达呈高度相关（P&<0.05，表1）.表1狭窄胆管组织中TGFβ1与TβRⅠ共同表达的关系（略）
　　3讨论
　　近年来，随着胆管手术和腹腔镜胆囊切除术（laparoscopic cholecystectomy， LC）的广泛开展，胆管损伤和损伤性胆管狭窄的发生率有增加趋势. 此外，与肝胆管结石相关的炎性胆管狭窄发生率仍然较高. 目前良性胆管狭窄的治疗研究大多局限于损伤或狭窄形成后的各种修复、重建手术方面，由于修复不能改变瘢痕及狭窄形成这一病理过程的再次发生，手术效果不甚理想，术后再狭窄率较高. 增生性瘢痕中成纤维细胞数目及胶原合成水平较正常组织明显提高，表现为胶原的大量合成和过度的沉积. 因此抑制胶原合成，促进其降解是治疗病理性瘢痕的关键. 而胆管手术或损伤后的胆管修复愈合过程中，瘢痕增生是胆管狭窄的主要原因［4］. 瘢痕增生是由于各种原因引起成纤维细胞的异常增殖和胶原纤维大量合成，导致细胞外基质（extracellular matrix， ECM）中胶原过度沉积所致［5］. 成纤维细胞是创面愈合的主要修复细胞，直接影响胶原合成和分泌，其合成的胶原又是构成细胞外基质的主要成分. TGFβ是成纤维细胞的强效趋化因子，可以通过旁分泌和自分泌直接或间接、单独或协同、同时或不同时相作用于炎症及修复细胞，产生细胞的趋化性迁移、增生分化、细胞外基质合成及分泌三类重要的生物学效应. 在损伤后的组织修复中，血小板在损伤部位通过脱颗粒方式释放无活性的前体TGFβ，经酶或者急性炎症反应的酸性微环境激活后［6］，TGFβ通过自身诱导作用使激活的巨噬细胞、T淋巴细胞、增殖的上皮细胞和成纤维细胞表达TGFβ，继而刺激成纤维细胞合成胶原和其他细胞外基质，抑制胶原蛋白分解，增加新生小血管，诱导创伤修复顺利进行. 此外TGFβ是刺激创面肉芽组织形成的最有效细胞因子，可增加伤口组织抗张强度和促使新血管再生. 同时TGFβ可能还参加了瘢痕形成中成纤维细胞的增殖凋亡水平调节［7-8］. TGFβ的异构体中，TGFβ1是强烈的促细胞分裂剂. TGFβ1通过与高亲和力的表面膜受体特异性结合发挥其生物学作用，其中TβRⅠ活化是TGFβ1信号转导的起点，也是最关键的一步［9］.

TGFβ1结合并激活Ⅰ型受体后，经过一系列受体后信号分子的相互作用调控相关基因，促进成纤维细胞合成Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白（fibronectin，FN），增加Ⅰ型胶原和FN的mRNA水平，刺激Ⅰ型胶原启动子和FN的活性，降低蛋白酶的合成和分泌，抑制胶原酶的活性，减少ECM的降解. 通过这一系列连锁反应，扰乱了胶原合成与降解的平衡，结果导致ECM过度积聚，刺激分泌更多的TGFβ1，最终导致纤维化和瘢痕形成.
　　我们既往的研究表明，TGFβ1在犬胆管愈合过程中呈高表达［10］. 在此基础上，进行临床病例研究. 本实验病例组为良性胆管狭窄标本，结果显示TGFβ1及其受体TβRⅠ在术后狭窄胆管组织中均为高表达，与正常胆管比较差异有显著性意义（P&<0.05），表明二者的高表达与胆管瘢痕增生、良性狭窄形成有着密切关系. TGFβ1与TβRⅠ阳性表达见于肉芽组织、成纤维细胞、纤维细胞及血管内皮细胞，显示在胆管组织修复过程中，被激活的成纤维细胞和增殖的内皮细胞表达TGFβ1，继而刺激成纤维细胞合成胶原和其他细胞外基质，抑制胶原蛋白分解，增加新生小血管，诱导创伤修复进行. 我们发现在胆管良性狭窄形成过程中TGFβ1及其受体持续高表达，本组病例平均病程为16 mo，成纤维细胞功能异常活跃，扰乱了胶原合成与降解的平衡. 这一现象可能与胆汁致炎特性有关. 在修复胆管缺损处，胆汁的持续接触刺激导致反复炎症，TGFβ1持续高表达，刺激成纤维细胞产生胶原及其基质成分并沉积，导致瘢痕增生，最终狭窄形成. 因此通过抑制TGFβ1过度表达及其信号传导，可望预防胆管瘢痕增生和狭窄，为临床预防良性胆管狭窄提供新的思路和方法.

【参考文献】
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　　［3］Tateshita T， Ono I， Kaneko F. Effects of collagen matrix containing transforming growth factor (TGF)beta(1) on wound contraction［J］. J Dermatol Sci， 2001， 27(2):104-113.

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　　［9］Laping NJ， Grygielko E， Mathur A， et al. Inhibition of transforming growth factor(TGF)beta1induced extracellular matrix with a novel inhibitor of the TGFbeta type receptorⅠ kinase activity: SB431542［J］. Mol Pharmacol， 2002， 2(1):58-64.

　　［10］耿智敏，向国安，刘效恭，等.转化生长因子β1在胆管愈合过程中的表达及意义［J］.中国普外基础与临床杂志， 2000，7（6）：362-363.