RNA干扰技术抑制EC109细胞survivin基因表达及其促凋亡分析

【摘要】 目的：应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对survivin基因的siRNA，抑制survivin基因的表达并诱导食管癌细胞系EC109细胞的凋亡. 方法：构建针对survivin的siRNA表达质粒，转染至EC109细胞，荧光显微镜判断转染效率，蛋白质印迹和半定量RTPCR检测survivin蛋白表达及基因转录水平的变化，并在不同时间点收集转染细胞，利用流式细胞术及基因组DNA凋亡检测试剂盒，观察siRNA抑制survivin基因表达后诱导细胞凋亡的情况. 结果：荧光显微镜结果表明，重组质粒转染效率达46.70％. 半定量RTPCR检测到pSIREN/S质粒在EC109细胞内对survivin基因的转录抑制率为74.04%；蛋白质印迹结果表明，转染重组质粒pSIREN/S的EC109细胞survivin蛋白表达量仅为正常组的41.64%，而对照质粒pSIREN/CN对survivin基因的蛋白表达及转录均没有抑制作用. 经pSIREN/S转染的EC109细胞基因组DNA出现明显的DNA ladder，流式细胞仪分析结果也显示凋亡细胞为60.78%. 结论：survivin特异性siRNA可明显抑制survivin基因的转录和表达，并能有效地诱导EC109细胞的凋亡，为下一步在体内利用pSIREN/S重组质粒沉寂survivin基因，促肿瘤细胞的凋亡提供实验基础.
【关键词】 RNA干扰技术 食管肿瘤 survivin基因 EC109细胞
　　0引言
　　潮汕地区是中国六大食管癌高发区之一，据统计，广东省南澳县恶性肿瘤死因构成的排位顺序为食管癌最高，占恶性肿瘤死亡总数的半数以上［1］. 因此对于食管癌特别是中晚期患者，寻找有效的治疗手段至关重要. survivin是IAP（inhibite apoptosis protein）家族成员之一，具有抑制凋亡的作用；同时也是细胞周期调节蛋白，通过干扰细胞的有丝分裂以调节细胞的凋亡［2］. 已有文献［3-5］报道，食管癌患者的肿瘤组织中survivin 的表达明显高于正常组织，我们利用siRNA技术，以食管癌EC109细胞株为模型，利用survivin特异性siRNA，对survivin基因的转录、表达及其诱导EC109细胞凋亡进行了研究.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　人食管鳞癌细胞株EC109为汕大医学院沈忠英教授馈赠. 大肠杆菌DH5α及RNAi载体质粒RNAiReadypSIRENDNRDsRedExpression购自Invitrogen公司. RPMI1640、小牛血清、胰蛋白酶等购自Sigma公司. 脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司. 兔抗人survivin单抗购自Santa Cruze，CY3标记的羊抗兔IgGFc抗体购自武汉博士德公司. 限制性核酸内切酶EcoR I，BamH I等购自NEB公司. T4 DNA连接酶、DL 2000标准Marker由TaKaRa公司提供. 质粒提取试剂盒购自上海博光生物技术有限公司. RNaeasy Kit购自Qiagen公司.
　　1.2方法
　　1.2.1抑survivin siRNA序列及载体构建
　　根据survivin的编码序列及以往的研究资料，结合siRNA序列设计原则并利用Blast进行查询，确定其为特异性survivin RNA干扰的靶序列， 其正义链: 5′ gat cca aag cat tcg ggt tgc ttc aag acg gca acc gga cga atg ctt ttt ttt tga att ca 3′， 反义链: 3′ agc ttg aat tca aaa aaa aag cat tcg tcc ggt tgc cgt ctt caa gca acc gga cga atg ctt tg 5′. 为排除siRNA本身的影响，我们设计了无关的siRNA序列，CN序列，即正义链为：5′gat ccg act tca taa ggc gca tgc ttc aag acg gca tgc gcc tta tga agt ctt ttt tgt cga ca3′，反义链为：3′gct gaa gta ttc cgc gta cga agt tct gcc gta cgc gga ata ctt cag aaa aaa cag ctg ttc ga5′. 所有的寡核苷酸片段均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成. 退火后分别插入经BamH I和EcoR I线性化的载体pSIREN中，构建重组载体pSIREN/S和pSIREN/CN. 转化大肠杆菌DH5α，挑取氨苄青霉素抗性菌落并扩增培养，然后快速小量制备质粒并进行核酸测序鉴定，选择序列正确的克隆扩大培养.
　　1.2.2细胞培养与转染EC109细胞株常规培养于
　　RPMI1640培养基中，每2～3 d经2.5 g/L的胰酶消化，传代培养. 采用LipofectamineTM 2000 (Invitrogen)脂质体转染法转染，操作流程按照说明书进行. 将正常培养的EC109细胞用胰酶消化，1000 r/min离心5 min，以2×108个细胞/L重悬于培养基，2 mL/孔接种于六孔板中，待细胞生长密度约为70%～80%时，更换无血清、无抗生素培养基. 实验分为三组，即pSIREN/S， pSIREN/CN和未转染对照组. 转染后6 h更换正常培养基，12 h后在荧光显微镜与流式细胞仪下观察DsRed的表达，推测转染效率.
　　1.2.3半定量RTPCR检测
　　EC109细胞survivin mRNA的表达分别于转染后24，36，48，72和96 h收集pSIREN/S细胞及pSIREN/CN和未转染对照组细胞各2×106个，PBS洗涤两遍，提取各组细胞总RNA. 逆转录引物采用Uni12和PolyT进行，在RTPCR反应体系中加入二对引物， 第一对是内源对照GAPDH (336~1235 bp)， 5′cga agg tga agg tcg gag tc3′和5′gac cac ctg gtg ctc agt gt3′，第二对是被沉寂的目的基因的引物，即survivin (991~1500 bp)， 5′ata gtc gac atg ggt gcc ccg acg ttg3′和5′ctc gga tcc tca atc cat ggc agc cag3′. 扩增片段为509 bp. 具体操作过程参照逆转录试剂盒说明书. 利用GeneTools软件测定GAPDH及survivin的A值，结果以其和内参照GAPDH的A值来反映其相对含量，确定survivin基因在不同时间点被siRNA沉寂的程度.
　　1.2.4免疫荧光染色
　　生长在盖玻片上的细胞用40 g/L多聚甲醛室温下固定20 min， 0.5 g/L胰酶、30 mL/L过氧化氢(甲醇配制)各处理30 min后，正常羊血清封闭30 min. 加入一抗（兔抗人survivin，Santa Cruze， 1∶200） 4℃湿盒过夜，PBST漂洗后，加入二抗（Cy3标记的羊抗兔IgG，博士德，1∶100），室温下染色1 h，漂洗后荧光倒置显微镜下观察并照相.
　　1.2.5Western Blot检测
　　EC109细胞survivin蛋白的表达收集各组细胞，PBS洗涤2遍，细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，紫外分光光度计法进行蛋白质定量. 安装垂直电泳仪，配制100 g/L SDS分离胶及浓缩胶，取60 μg样本上样. 电泳后用电转仪恒流（35 mA）转移蛋白3 h后，取出转印膜（NC膜），丽春红S染液染色，再经50 g/L脱脂牛奶封闭、兔抗人survivin一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，加入1∶3000羊抗兔IgG/HRP，室温孵育2 h，用辣根过氧化物酶/LumiGLO化学发光法进行Western检测.
　　1.2.6提取基因组DNA，电泳观察DNA ladder的形成
　　收集待测细胞用PBS洗1次. 按试剂盒说明提取基因组DNA. 行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下照相、观察.
　　1.2.7流式细胞仪检测
　　转染细胞凋亡分别收集各组细胞1×106个，PBS洗涤3次后700 mL/L乙醇固定，PBS洗涤后用2 mL/L Triton100破细胞膜，再加入PI染液及RNase避光染色30 min. 流式细胞仪检测细胞凋亡情况.
　　统计学处理：所有实验均重复3次，采用计算机统计分析软件SPSS11.0对半定量RTPCR数据进行配对t检验. 各处理组与正常对照组进行比较，P&<0.05即认为有统计学差异.
　　2结果
　　2.1质粒图谱、转录产物及重组子的的鉴定
　　siRNA表达载体及其多克隆位点(图1)和在U6启动子的作用下所表达的小发夹RNA（small hairpin， shRNA，图2）中有19个正义与反义核苷酸序列，两者以9个核苷酸的loop环相连. siRNA转录后，折叠形成如图所示的dsRNA发夹样结构. pSIREN/S采用EcoR I和BamH I进行酶切鉴定，经双酶切后产生一个约100 bp的片段. 筛选阳性克隆质粒送测序，测序结果完全吻合，表明构建重组子完全正确.
　　2.2pSIREN/S真核载体的转染及阳性克隆的鉴定
　　用阳离子脂质体转染法，将重组体pSIREN/S和pSIREN/CN分别转染至EC109细胞中，观察红色荧光表达量. 除空质粒对照组细胞呈现阴性外，pSIREN/S和pSIREN/CN实验组在转染12 h后可见荧光蛋白表达且在整个细胞中均匀分布，24 h后明显，48～72 h达高峰. 经流式细胞仪观察表达DsRed的阳性细胞可达46.7％(图3).

　　2.3survivin mRNA表达的变化
　　转染pSIREN/S后，EC109细胞的PCR产物电泳条带较对照组明显减弱，而不影响GAPDH的表达，而转染阴性对照质粒的EC109细胞无明显改变(图4). 转染pSIREN/S后EC109细胞mRNA表达量随时间增加而减少，72 h达到高峰. 应用GeneTools图像系统分析结果，分别得出各组GAPDH和survivin的A值，用H检验进行分析. H检验分析可见，转染pSIREN/S 36 h后EC109细胞mRNA表达量与转染前（正常EC109细胞对照组）之间的差异有显著意义（n=3， P&<0.01， 表1）. 36， 48， 72及96 h Suvivin mRNA的量仅为正常对照组的57.17%， 64.17%， 25.96%和27.55%.表1GeneTools图像系统分析(略)
　　2.4免疫荧光染色分析
　　转染前后survivin的表达变化未转染细胞对照组和pSIREN/CN的细胞均呈上皮性贴壁生长，细胞轮廓清晰、透亮无颗粒，形态一致，细胞间结构紧密，生长旺盛；转染pSIREN/S组的细胞于24 h起细胞开始收缩变圆，少数细胞漂浮，细胞中颗粒增多，细胞周围碎片随时间而增多. 利用免疫荧光染色分析转染pSIREN/S后对EC109细胞survivin表达量的影响(图5).
　　2.5survivin蛋白的表达变化
　　Western Blot检测结果显示，转染pSIREN/S后EC109细胞survivin蛋白的表达量较正常组减少. 与RTPCR结果对应的是，survivin蛋白的表达量也随着转染的时间而进一步减少，于72 h达到最低(图6). 应用BandScan图像系统分析结果所示，以EC109细胞对照组的survivin/GAPDH蛋白带为标准（亮度定为100），其他几组与之比较，转染质粒pSIREN/CN的条带强度为96%，转染pSIREN/S 24 h，48 h，72 h和96 h的条带强度分别为68.40%，53.13%， 41.64%和41.84%.
　　2.6survivin对EC109细胞凋亡的影响
　　收集各组细胞，提取基因组DNA观察DNA ladder的形成，并行流式细胞仪检测细胞凋亡情况(图7). 流式细胞仪检测显示，未转染pSIREN/S的EC109细胞无凋亡峰的出现，而转染的出现了明显的凋亡峰，细胞凋亡率达到60.78%.
　　3讨论
　　survivin是IAP（inhibition of apoptosis protein）家族的成员之一. survivin在成人终末分化组织一般不表达或低表达，但在人类常见的肿瘤组织中呈高度表达. survivin可对抗G2/M期凋亡的诱导，可促使癌细胞突破凋亡的关卡(checkpoint)，使肿瘤细胞免于凋亡［6-7］. survivin主要能通过caspase依赖和非依赖两条途径来发挥抗凋亡作用［8］. survivin抑制凋亡的作用吸引了众多科学家对其研究的兴趣抑制survivin蛋白的表达，促使肿瘤细胞凋亡已经掀开了肿瘤研究的新热潮［9-10］. 在国内，抑制survivin表达的研究多采取反义技术进行操作，并已初步取得良好效果. 本文采用siRNA的方法旨在更进一步地抑制其表达，诱导肿瘤细胞凋亡.
　　本研究显示，瞬时转染pSIREN/S的EC109细胞，其survivin无论在mRNA水平还是蛋白水平都明显降低，在72 h达到高峰. 在mRNA水平上，转染pSIREN/S后72 h survivin mRNA下降了74.04%. 而在蛋白水平上，72 h的survivin蛋白量仅为正常组的41.64%. 而重组质粒pSIREN/CN对survivin基因无抑制作用，表明重组质粒pSIREN/S具有特异性抑制目的基因的作用. 更为重要的是，在转染pSIREN/S重组质粒的EC109细胞中，细胞在一定程度上发生了凋亡. 本研究为下一步在体内利用重组质粒pSIREN/S沉寂survivin基因，促肿瘤细胞的凋亡提供了实验基础. 进一步的研究正在进行中.

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