关于Peutz　Jeghers综合征错构瘤性息肉APC，NGAL，COX2基因表达及意义

【摘要】 目的：研究APC，NGAL，COX2基因在PeutzJeghers综合征（PJS）错构瘤性息肉中表达及在PJS息肉发生、发展中的意义. 方法：24例PJS患者28个PJS错构瘤性息肉，23例大肠癌和20例正常结肠粘膜组织石蜡包埋切片，经免疫组织化学SP法染色，显微镜下观察阳性蛋白表达情况. 结果：APC在正常结肠粘膜表达全部阳性，PJS息肉组表达阳性率89.3%（25/28），大肠癌组为43.5%（10/23），3组间率的差异有统计学意义（P&<0.05）. NGAL在正常结肠粘膜组表达阳性率10%（2/20），PJS息肉组表达阳性率71.4%（20/28），大肠癌组阳性率为73.9%（17/23），三组间率的差异有统计学意义（P&<0.05）. COX2在正常结肠粘膜组全部阴性，PJS息肉组表达阳性率67.9%（19/28），大肠癌组为82.6%（19/23），3组间率的差异有统计学意义（P&<0.05）. 结论：APC失表达可能未在PJS息肉发生、发展中起主要作用. NGAL，COX2可能与PJS息肉发生、发展有关.
　　
【关键词】 PeutzJeghers综合征 APC基因 NGAL基因 COX2基因
　　0引言
　　PeutzJeghers综合征（PeutzJeghers syndrome，PJS）是以皮肤粘膜黑斑、胃肠道多发错构瘤性息肉、肿瘤发生率增高为主要特征的常染色体显性遗传病. STK11(serinethreonine protein kinase 11)/LKB1基因为PJS的相关致病基因，但研究发现并非所有PJS患者都发生STK11基因突变，因此PJS息肉的发生、发展过程中可能还存在其他基因的参与［1-2］. 我们研究APC，NGAL和COX2基因在PJS息肉表达，并以大肠癌及正常结肠粘膜作对照，以了解上述基因在PJS息肉发生、发展过程中所起的作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　1.1.1标本及处理
　　24例PJS患者，28个错构瘤性息肉取自广州南方医院和广州儿童医院2001/2005病理档案. 23例大肠癌标本取自南方医院病理档案. 20例正常组织取自门诊体检者正常结肠粘膜. 所有标本均经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，连续以4 μm厚度切片，HE染色后经病理医师行病理诊断.
　　1.1.2主要试剂
　　APC兔抗人多克隆抗体（C20）为Santa Cruz公司产品，NGAL大鼠抗人单克隆抗体购自R&&D Systems公司，COX2鼠抗人单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒（SP9000）为北京中杉金桥生物技术有限公司产品.
　　1.2方法
　　1.2.1免疫组织化学检测
　　免疫组织化学SP法及步骤参照试剂盒说明. 显色底物为二氨基联苯胺. 以PBS代替一抗作阴性对照，结果为阴性. APC结果判定：细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，连续观察10个高倍视野(400倍) ，以阳性细胞数超过10%作为阳性表达诊断标准. NGAL，COX2蛋白阳性结果判定:细胞质染色呈棕黄色至深棕黄色. 连续观察10个高倍视野(400倍)，以阳性细胞数超过10%作为阳性表达诊断标准，再根据阳性反应强度分为弱阳性(+)，中度阳性()和强阳性().
　　统计学处理: 各组间率的比较应用χ2检验，P&<0.05为有统计学差异.
　　2结果
　　2.1APC的表达
　　APC在PJS息肉、大肠癌、正常结肠粘膜的表达阳性率分别为89.3%，43.5%和100% (P&<0.05，表1）. 20例正常结肠粘膜APC表达全部阳性，为腺上皮细胞胞质染色（图1A）. PJS错构瘤性息肉粘膜肌束呈典型树枝状，有时可见插入肌束间的粘膜巢. 28个PJS息肉中25个APC表达阳性，为增生的腺上皮细胞胞质染色（图1B），23例大肠癌标本10例APC表达阳性，13例表达阴性.表1APC，NGAL和COX2在不同组的表达结果(略)
　　2.2NGAL的表达
　　NGAL在PJS息肉、大肠癌、正常结肠粘膜的表达阳性率分别为71.4%，73.9%和10.0%（P&<0.05，表1）. 在正常结肠粘膜组18例标本表达阴性，2例标本腺上皮细胞胞质中偶有弱表达. 28个PJS息肉中20个NGAL表达阳性，染色于增生的腺上皮细胞胞质（图2A），23例大肠癌标本有17例表达阳性（图2B），阳性反应强度为（+）～（）.
　　2.3COX2的表达
　　COX2在正常结肠粘膜组表达全部阴性，COX2在PJS息肉增生的腺上皮细胞胞质表达，表达阳性率67.9%，大肠癌组为82.6%，阳性反应强度为（+）～（），3组间阳性率差异有统计学意义（P&<0.05，表1）. 其中28个PJS息肉有19个COX2表达阳性（图3A），23个大肠癌标本有19个表达阳性（图3B）.
　　3讨论
　　早期研究认为PJS息肉为错构瘤性息肉，无恶变倾向. 但随着研究的深入，研究人员发现不仅PJS患者消化道息肉发生恶变的风险增高，而且还常伴发多种胃肠道外器官的恶性肿瘤，其家族肿瘤发病率也较普通人群高［3］. 并非所有PJS患者都存在STK11基因突变，因此PJS息肉的发生、发展可能还存在其他基因的参与.
　　
　　APC基因突变可使APC蛋白形成截断改变，引起βcatenin在核内堆积，增强Wnt途径并异常激活下游基因，并失去对细胞骨架的调节功能，导致细胞异常增生及恶性生长，从而引起家族腺瘤性息肉病以及散发性大肠癌等恶性肿瘤的发生［4-6］. 本实验所用抗体可识别APC蛋白羧基末端区的2824～2843位氨基酸残基， APC基因突变常可导致蛋白截断，失去羧基末端［7］. 阴性表达一方面可能与APC基因杂合缺失导致其表达降低，蛋白含量过少有关;另一方面可能与APC基因突变产生突变型蛋白，抗体识别位点消失有关. 因此可认为采用免疫组化法检测出的APC蛋白表达缺失反映出APC基因的异常.
　　NGAL可能是人类新的癌基因［8］. 研究发现NGAL在正常大肠粘膜中偶有弱表达，而在结肠肿瘤、胰腺癌等多种恶性肿瘤组织中表达明显增强［9-10］. 有学者将转染了能稳定表达NGAL的人类乳腺癌细胞株 MCF7皮下注射入免疫缺陷小鼠后发现NGAL表达增强，并且明显促进肿瘤的生长［11］. Tong等［12］应用药物诱导人肺腺癌细胞株A549凋亡时，发现细胞NGAL mRNA水平显著提高，在转染了过表达NGAL的细胞株中细胞凋亡数明显减少，用小干扰RNA减少细胞株中NGAL mRNA水平和蛋白表达可增强药物毒性，提示NGAL有抗凋亡作用. 这些研究表明NGAL可能通过促进肿瘤细胞生长、抑制细胞凋亡等方面在肿瘤的发生、发展中起作用. 本研究中28个PJS错构瘤息肉有20个NGAL过表达， 阳性表达率与大肠癌组相似， 与正常粘膜比较有明显差异， 提示NGAL可能参与了PJS息肉发生、 发展过程， 其机制也可能通过促进细胞生长、 抑制细胞凋亡起作用.

　COX2是前列腺素合成关键限速酶环氧合酶（COX）的同工酶，近年的研究表明COX2在多种恶性肿瘤中普遍存在过度表达现象［13-14］. 有学者发现COX2的前列腺素产物可增强正常和肿瘤细胞增殖和生长，COX抑制剂可阻断此作用［15］. Tsujii等［16］的研究发现转染了能持久表达COX2载体的大鼠肠上皮细胞过度表达的COX2，可增强细胞对细胞外基质的粘附能力，引起Bcl2水平的升高，并可抑制丁酸盐诱导的凋亡. 另有研究发现鼠结肠上皮细胞中持续表达COX2时存在明显的G1期延迟，伴有cyclinD1蛋白激酶、Rb1激酶和细胞周期依赖激酶(CDK4)活性明显下降，通过阻碍细胞周期，阻止细胞凋亡，从而延长细胞生存期，引起一系列基因突变，促进肿瘤形成［17］. 本研究28个PJS息肉有19个在增生的腺上皮细胞胞质中存在COX2过表达，与大肠癌组表达阳性率相近，提示COX2可能通过促进细胞的增殖和生长，抑制细胞凋亡，延长细胞生存期，从而促进PJS息肉的发生，增加了PJS息肉发生恶变的可能性.
　　以上结果推测，PJS息肉的发生、发展及恶变可能是在STK11基因突变以及其他多种因素的共同参与下出现的.

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