关于CXCR4/SDF1对乳腺癌细胞MCF7增殖作用的影响

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【摘要】 目的：探讨CXCR4/SDF1生物学轴对人乳腺癌细胞MCF7生长与增殖的影响. 方法：采用Western Blot免疫印迹法检测MCF7细胞CXCR4蛋白的表达. 以CXCR4单克隆抗体（CXCR4 mAb）作用MCF7细胞，通过MTT比色法、软琼脂克隆形成实验和细胞周期检测观察MCF7细胞的生长情况；通过流式细胞仪检测MCF7细胞的增殖细胞核抗原（PCNA）表达. 结果：MCF7细胞表达CXCR4蛋白；CXCR4 mAb作用后，MCF7细胞生长能力明显降低，并且PCNA蛋白含量由对照组的（91.6±5.3）％降为（78.1±3.6）％（P&<0.05）. 结论：CXCR4 mAb可明显抑制MCF7细胞的增殖.
【关键词】 CXC趋化因子受体4 基质细胞衍生因子 MCF7细胞 CXCR4单克隆抗体 增殖
　　0引言
　　近年研究表明，肿瘤细胞可以表达某些趋化因子（chemokines）或趋化因子受体，并且趋化因子及其受体可能通过与炎症细胞浸润相似的机制参与肿瘤细胞的发生、发展与侵袭转移过程［1-2］. CXC趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）与其配体-趋化因子CXCL12，即基质细胞衍生因子1（stromal cellderived factor1， SDF1）相互作用构成一个细胞信息传递的生物学轴（biological axis），决定着肿瘤细胞的生长与转移过程［3］. 目前，肺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病等众多肿瘤细胞中均发现有CXCR4的高表达，并且CXCR4已成为肿瘤诊断与治疗的新靶点，越来越多受到人们的重视［4］. 已有研究表明，CXCR4/SDF1生物学轴不仅对乳腺癌细胞的转移起关键作用［3］，而且与乳腺癌细胞的生长也有着密切的联系［5-6］. 我们以乳腺癌细胞系MCF7为研究对象，采用CXCR4 mAb进行体外实验性干预，观察MCF7细胞的生长能力及细胞增殖相关蛋白的变化，以阐明CXCR4/SDF1生物学轴对乳腺癌细胞增殖的影响.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　人乳腺癌细胞系MCF7由第四军医大学航空航天医学系谢满江博士惠赠；CXCR4 mAb（IgG2b 44717.111 clone)购于美国Sigma公司；噻唑蓝（tetrazoliumblue，MTT）、碘化丙啶（propidium iodide， PI）为美国Sigma公司产品；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、羊抗鼠FITCHRP抗体与鼠抗人增殖细胞核抗原（proliferating cell nucleus antigen， PCNA）抗体购于北京华美公司. MCF7细胞用RPMI 1640（含100 mL/L胎牛血清）在37℃， 50 mL/L CO2孵箱中常规培养.
　　1.2方法
　　1.2.1MCF7细胞CXCR4蛋白的表达取对数生长期的MCF7细胞，加入RIPA (RadioImmunoprecipitation Assay，美国Pierce)裂解液. 冰上静置10 min后，以4℃，10 000 r/min离心5 min后取上清. 采用BCA法（BCA protein assay reagent kit，美国Pierce）进行蛋白定量后，蛋白样品加入等体积的2×SDS凝胶上样缓冲液混匀，置于沸水浴中加热10 min. 蛋白样品（每孔上样量均为20 μg总蛋白）以80 mg/L SDS聚丙烯酰胺凝胶（Novex， San Diego， 美国CA）进行电泳分离，分离的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜（hybondECL membrane， 美国Amersham Life Science Inc.， Arlington Heights， IL）上. 4℃以含100 g/L脱脂奶粉的TBST封闭过夜后，加入用封闭液稀释的CXCR4 mAb（1∶1000）室温孵育1 h；以TBST洗膜3×10 min；以TBS稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗（1∶5000），室温孵育1 h后，以TBS洗10 min×2. 最后用增强的化学发光反应混合液（enhanced chemiluminescence，ECL，美国Pierce）显色，感光胶片（hyperfilm ECL， 美国Amersham Life Science Inc.， Arlington Heights， IL）曝光.
　　1.2.2MCF7细胞生长能力取对数生长期的MCF7细胞以2.5 g/L胰酶消化，再以5×106/L的细胞密度接种于96孔板. 37℃，50 mL/L CO2条件下培养过夜后，加入含有50 mg/L CXCR4 mAb的培养液（根据预实验结果，选取50 mg/L作为实验浓度)，空白对照组加相应体积的培养液. MCF7细胞分别培养24，48，72，96 h后，加入终浓度为5 mg/L的MTT 10 μL，继续培养4 h后吸取培养液，每孔加入DMSO 150 μL溶解结晶，充分振荡15 min，用酶联免疫检测仪测定各孔490 nm吸光度值（A490）. 绘制各组生长曲线并计算细胞存活率. 细胞存活率＝实验组各孔平均A490值/相应对照孔平均A490×100％. 另取对数生长期的MCF7细胞以2.5 g/L胰酶消化，再以400个/孔的细胞密度接种于已制备好琼脂培养基的6孔板中. 培养过夜后，以50 mg/L CXCR4 mAb作用48 h后，再以含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养14 d. 计数每组克隆数（50个细胞以上为一个克隆），克隆形成率＝平均克隆数/接种细胞数×100％.
　　1.2.3流式细胞仪测定细胞周期以50 mg/L的CXCR4 mAb作用MCF7细胞48 h后，PBS清洗. 制备单细胞悬液，1000 r/min离心5 min，弃上清. 以700 mL/L乙醇固定过夜，离心弃乙醇后加入RNA酶37℃作用2 h，再加入100 mg/L的PI混匀. 置冰上30 min后取1×106个细胞在流式细胞仪上进行细胞周期分析.
　　1.2.4MCF7细胞PCNA蛋白表达以50 mg/L的CXCR4 mAb作用MCF7细胞48 h后，PBS清洗. 制备单细胞悬液，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入PCNA一抗（20 mg/L）室温下孵育30 min，1000 r/min离心1 min，弃上清，PBS液洗涤3遍，加入羊抗鼠FITCHRP二抗（1∶2000）室温下孵育30 min，PBS液洗涤2遍，4℃预冷的700 mL/L乙醇固定，取1×106个细胞经流式细胞仪检测MCF7细胞PCNA蛋白的表达.
　　统计学处理：实验数据均以x±s表示. 各组间以Origin 6.1软件进行t检验比较. P&<0.05有统计学差异.
　　2结果
　　2.1MCF7细胞表达CXCR4蛋白MCF7细胞有CXCR4蛋白的表达，但在MCF7细胞培养液中无CXCR4蛋白表达，说明CXCR4蛋白属于非分泌型蛋白（图1）.
　　2.2CXCR4 mAb对MCF7细胞生长能力的影响与CON组相比，CXCR4 mAb可明显抑制MCF7细胞的生长速率（图2）；并且24，48，72，96 h后MCF7细胞的存活率逐渐降低，分别为（93.8±4.8）％，（71.0±2.8）％，（41.1±4.0）％，（36.0±3.1）％ （P&<0.05）. 在软琼脂克隆实验中，CXCR4 mAb可使MCF7细胞的克隆体积减小，克隆形成率从CON组的223.6±3.5显著降低为123.4±2.9（P&<0.05）.
　　2.3细胞周期的变化经CXCR4 mAb作用后48 h后，MCF7细胞在S期大量堆积，G2/M期细胞数量减少（表1）.表1流式细胞仪检测细胞周期(略)

转贴于 　2.4MCF7细胞PCNA蛋白的表达CXCR4 mAb作用MCF7细胞48 h后，其PCNA蛋白含量为（78.1±3.6）％ (n=3)，而对照组为（91.6±5.3）％ (n=3).
　　3讨论
　　CXCR4是一个编码352个氨基酸的G蛋白偶联受体，与趋化因子CXCL12（SDF1）相互作用，构成了CXCR4/SDF1生物学轴介导细胞迁移与信息传递. 近年研究发现， CXCR4/SDF1轴与多种肿瘤细胞的恶性表现密切相关，它们不仅在肿瘤细胞的定向迁移与浸润中起着重要的调节作用，而且与肿瘤细胞的增殖和分化有密切关系［4］. 在乳腺癌的研究中，Muller等［3］证实趋化因子受体CXCR4与CCR7在人乳腺癌细胞和转移癌细胞呈现高表达，他们认为乳腺癌可能利用SDF1和CXCR4的结合使癌细胞侵入正常组织形成转移肿瘤. Schmid等［5］还发现CXCR4在癌前病变及原位癌中也有表达，提示CXCR4可能是乳腺癌发生的早期分子事件. 最近，Lapteva等［7］发现缺少CXCR4表达的细胞增殖速率明显低于对照组细胞. 因此，以上研究均提示CXCR4/SDF1轴不但介导了乳腺癌细胞的转移与浸润，而且也调控着乳腺癌细胞的生长与增殖. 具有高增殖性是肿瘤细胞的生物学特性之一，我们证实乳腺癌MCF7细胞表达CXCR4蛋白，而采用CXCR4 mAb直接作用MCF7细胞后，观察到MCF7细胞生长受到明显抑制，PCNA表达水平下调，表明CXCR4 mAb对MCF7细胞的增殖有明显的抑制作用.
　　　
　　乳腺癌发病率日益增高，目前以手术为主的综合治疗虽然取得了很好的疗效，但复发和转移仍是影响生存率和死亡率的主要因素. 研究表明CXCR4/SDF1轴参与乳腺癌细胞增殖与转移，无疑为肿瘤研究开辟了一个新的天地. 本实验结果表明CXCR4单克隆抗体可抑制乳腺癌细胞的增殖，可对临床药物治疗乳腺癌提供新思路. SDF1/CXCR4轴对肿瘤的作用机理还需从各个方面进行系统深入地研究.

参考文献

　　［1］Horuk R. Chemokines beyond inflammation ［J］. Nature， 1998， 393(6685): 524-525.

　　［2］马飞，宁力，张颖妹，等. 趋化因子受体CCR7促进乳腺癌细胞的趋化与侵袭［J］. 第四军医大学学报， 2004，25(20)：1883-1886.

　　［3］Muller A， Homey B， Soto H， et al. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis ［J］. Nature， 2001， 410(6824): 50-56.

　　［4］De Clercq E. Potential clinical applications of the CXCR4 antagonist bicyclam AMD3100 ［J］. Mini Rev Med Chem， 2005， 5(9): 805-824.

　　［5］Schmid BC， Rudas M， Rezniczek GA， et al. CXCR4 is expressed in ductal carcinoma in situ of the breast and in atypical ductal hyperplasia ［J］. Breast Can Res Treat， 2004， 84(3): 247-250.

　　［6］Smith MC， Luker KE， Garbow JR， et al. CXCR4 regulates growth of both primary and metastatic breast cancer ［J］. Can Res， 2004， 64(23): 8604-8612.

　　［7］Lapteva N， Yang AG， Sanders DE， et al. CXCR4 knockdown by small interfering RNA abrogates breast tumor growth in vivo ［J］. Cancer Gene Ther， 2005， 12(1): 84-89.