关于促性腺激素及IL6对卵巢癌细胞株核因子κB表达的影响

【摘要】 目的：探讨促性腺激素及IL6对卵巢癌细胞株核转录因子κB（NFκB）表达的影响. 方法：应用不同剂量的人重组促性腺激素及人重组白介素6（hrIL6）与卵巢癌细胞株OVCAR3， Caov3共培养，应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观测其对卵巢癌细胞生长的影响，同时应用RTPCR和ELISA方法检测卵巢癌细胞NFκB水平，以分析其信号传导途径. 结果：促性腺激素对卵巢癌细胞株具有促增殖作用，分别增加35％~202％（P＜0.05）；67.7％~192％（P＜0.01），并使细胞内NFκB亚单位表达增加1.53倍~3.98倍（P＜0.05），与对照组相比差异具有显著性. 在处理组卵巢癌细胞培养液中加入50 mg/L抗IL6中和性抗体，上述2种卵巢癌细胞株的生长均有所减慢，NFκB表达下降. 结论：提示促性腺激素对卵巢癌细胞株的促增殖过程可能由IL6介导，促性腺激素、IL6及NFκB共同影响卵巢癌细胞的生长.
【关键词】 卵巢肿瘤 促性腺激素 白细胞介素6
　　0引言
　　内分泌和免疫系统之间互相作用，互相制约，是机体重要的调控系统. 其共同的调节因子就是神经肽和激素. 为了探索原发上皮性卵巢癌中神经内分泌免疫网络调节功能的变化及其在卵巢癌发生发展中的作用，我们探讨促性腺激素、IL6在卵巢癌发生发展中的作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　卵巢上皮性癌细胞株OVCAR3，Caov3购自美国ATCC. Trizol (GIBCO公司). Access RTPCR一步法试剂盒（Promega公司）.核提取试剂盒（Active Motif）. NFkB检测试剂盒（Active Motif）. FSH，LH，IL6，抗IL6中和性抗体（Sigma）. NFκB p50上游引物：5′CAC CTA GCT GCC AAA GAA GG3′，下游引物：5′AGG CTC AAA GTT CTC CAC CA3′，产物长度为399 bp；NFκB p65上游引物：5′TCA ATG GCT ACA CAG GAC CA3′，下游引物：5′CAC TGT CAC CTG GAA GCA GA3′，长度为308 bp.人IL6酶联免疫检测试剂盒（R&&D）.
　　1.2方法
　　取浓度为2×108/L对数生长期OVCAR3， Caov3细胞，加入96孔板中，每孔100 μL，每组6孔或每个T75细胞培养瓶加入4×105个对数生长期OVCAR3， Caov3细胞，37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度培育24 h弃去培基，更换含有100 mL/L活性炭吸附的胎牛血清RPMI 1640培养基培养24 h，以去除原血清所含激素对细胞生长的影响.
　　1.2.1MTT实验检测卵巢癌细胞的增殖细胞培养基中加入相应的处理因素①促性腺激素（FSH/LH）终浓度：0，20，40，60，80，100 U/L；②不同终浓度促性腺激素（FSH/LH）及50 mg/L抗IL6中和性抗体，对照组只加入RPMI 1640培养基. 作用96 h，行MTT实验.
　　1.2.2细胞培养上清液中IL6含量检测ELISA法检测经不同浓度促性腺激素处理的卵巢癌细胞培养上清液中IL6含量.
　　1.2.3NFκB活性检测实验组分为两组. ①加入终浓度为100 μg/L的IL6或100 U/L的促性腺激素，②在加入IL6或促性腺激素的同时加入终浓度为50 mg/L抗IL6中和性抗体. 对照组只加入RPMI 1640培养基. 严格按照试剂盒说明书操作［1］，分别提取T75细胞培养瓶中卵巢癌细胞株细胞质及细胞核物质，-80℃冰箱保存以备用，使用ELISA法分别检测胞质与胞核中NFκB的含量；RTPCR法检测NFκB mRNA：采用Trizon试剂一步法提取总RNA. RTPCR反应条件：48℃逆转录45 min，94℃ AMV逆转录酶灭活/RNA/cDNA/引物变性2 min，PCR扩增条件为：94℃变性30 s， 56℃退火1 min，68℃延伸2 min，35个循环，68℃ 7 min(末次循环)，4℃保温. 反应结束后使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以100 bp DNA Marker为分子大小标记，在紫外灯下观察并照相. 使用BioMedia软件分析PCR产物. 以GAPDH作为内参照，以靶基因/GAPDH光密度的比值作为mRNA的相对表达丰度.
　　统计学处理: 数据以x±s或百分数表示， 采用SPSS11.0统计软件处理，两样本均数比较采用t检验， 2个以上样本均数的比较采用方差分析，多个实验组与一个对照组均数比较采用最小显著法（LSD）.
　　2结果
　　2.1卵巢癌细胞的增殖FSH可促进OVCAR3，Caov3细胞增殖. 当FSH浓度为40 U/L时， OVCAR3，Caov3细胞株较对照组细胞增殖率分别增加了35%和67.7% (P&<0.05);当FSH浓度为100 U/L时，细胞增殖率较对照组细胞增了202%，192%(P&<0.01). 在卵巢癌细胞培养液中分别加入50 mg/L抗IL6中和性抗体，2种卵巢癌细胞的生长均有所减慢. LH的结果与FSH的结果类似. 无免疫活性的兔IgG单独与上述两种细胞株培育，对细胞的增殖均无影响. 在IL6终浓度为100 μg/L时，OVCAR3，Caov3增殖率分别为对照组的394%和381%. 抗IL6中和性抗体可封闭此作用.
　　2.2核转录因子NFκB的表达将OVCAR3，Caov3细胞株的对照组NFκB 亚单位p50，p65 mRNA的表达量分别设定为1. 两种卵巢癌细胞株经浓度为100 U/L的FSH，LH或100 μg/L的IL6诱导，其NFκB亚单位p50和p65的mRNA较对照组均升高2~3倍. 经统计学检验两种细胞株激素处理组与对照组中NFkB亚单位的差异具有统计学意义(P&<0.05）. 当促性腺激素或IL6分别与抗IL6中和性抗体同时与上述两种细胞株共同孵育时，促表达作用较促性腺激素组有明显下降，FSH＋IL6抗体处理组p50分别降至1.12和1.31，p65分别降至1.24和1.26；LH＋IL6抗体处理组p50分别降至1.19和1.34，p65分别降至1.20和1.28；IL6＋IL6抗体处理组p50分别降至1.10和1.13，p65分别降至1.13和1.10. 在促性腺激素或IL6的诱导下，NFκB亚单位p50和p65蛋白表达量也有所增加，Caov3， OVCAR3细胞株核提取物中的NFκB亚单位p50和p65含量较对照组分别增加1.35倍~3.98倍. 当这两种卵巢癌细胞株与促性腺激素及其抗IL6中和性抗体共同孵育时，抗IL6中和性抗体部分抑制了促性腺激素FSH或LH诱导的NFκB亚单位p50和p65含量的增加.
　　2.3肿瘤细胞分泌IL6经FSH或LH处理后，IL6在两种卵巢癌细胞株培养上清液中的含量均有升高，并且随着促性腺激素浓度的升高，诱生IL6水平有升高趋势(P&<0.05， 表1).表1促性腺激素诱导肿瘤细胞分泌IL6(略)
　　3讨论
　　FSH可参与卵巢上皮分化、增殖、恶性变以及卵巢癌细胞的生长［2-4］. 如果改变卵巢癌患者体内的内分泌环境，可有助于提高手术或化疗效果，减少复发. 我们发现在促性腺激素FSH，LH的作用下，卵巢癌细胞株的增殖能力加强，与Viqar等［5］的研究结果一致. 近年来发现促性腺激素可通过调节一些细胞因子对上皮性卵巢癌发挥调控作用［6-8］. 本文着重探讨在卵巢癌的发生发展中促性腺激素，IL6和NFκB所起的作用. 我们利用促性腺激素FSH，LH刺激卵巢癌细胞株，发现在卵巢癌细胞培养的上清液中IL6含量有升高趋势，同时发现外源性IL6可促进卵巢癌细胞株的增殖. 这说明卵巢癌的发生发展与IL6不适当的调节有关，其中NFκB为IL6的重要调节因子.

　　抑制肿瘤细胞NFκB的活性将引起肿瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的生长，我们发现促性腺激素刺激的卵巢癌细胞NFκB的表达较对照组显著升高，且这种升高趋势可以部分被抗IL6中和性抗体所逆转，同时抗IL6中和性抗体还可部分抑制由促性腺激素所引起的卵巢癌细胞株的增殖. 这些结果提示在促性腺激素诱导卵巢癌细胞株增殖以及NFκB表达增加这一过程，可能有IL6的参与. 现已证实卵巢癌患者血清和腹水中IL6浓度显著高于正常人群及良性卵巢肿瘤患者［9］. Yamagucchi等［10］发现，IL6蛋白在体外能促进垂体细胞释放FSH，LH，和PRL，这样IL6与促性腺激素在卵巢癌患者体内有可能形成级联放大效应. 肿瘤患者体内高浓度的促性腺激素可通过IL6激活滞留在细胞质中NFκB，使其由细胞质移位到细胞核中，与靶基因启动子区域的κB位点相结合，调节靶基因的表达. 一方面可以诱导IL6的高表达促进细胞增殖，减少凋亡. 另一方面可直接上调凋亡抑制因子，TNF受体相关因子，锌指蛋白A20、超氧化锰歧化酶等抗凋亡因子的表达.

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