关于Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌SGC7901细胞凋亡及对白藜芦醇的增敏作用

【摘要】 目的：观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌SGC7901细胞的增殖、凋亡及对白藜芦醇敏感性的影响. 方法：人工合成survivin硫代ASODN，通过脂质体转染胃癌细胞株(SGC7901)后，用MTT法检测细胞毒作用；用荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡；RTPCR、免疫组化技术检测survivin mRNA及蛋白的表达. 结果： ①survivin ASODN抑制胃癌SGC7901细胞的增殖呈时间和剂量依赖性； ②survivin ASODN处理组SGC7901细胞24 h后凋亡率为(33.6±1.2)%，正义寡核苷酸(SODN)组为(10.7±0.8)%，两组相比，差异有显著性(P&<0.05)；③survivin ASODN处理组SGC7901细胞survivin蛋白及mRNA的表达水平显著下降. ④survivin ASODN和白藜芦醇联合处理组SGC7901细胞24，48，72 h生长抑制率，显著高于单用survivin ASODN组(P&<0.05)和单用白藜芦醇组(P&<0.05). 结论：survivin ASODN能够抑制胃癌SGC7901细胞的增殖、诱导凋亡，并能增加胃癌细胞株SGC7901对白藜芦醇的敏感性，推测可能通过下调survivin mRNA及蛋白表达而起作用.
【关键词】 反义寡核苷酸 白藜芦醇 Survivin基因 胃肿瘤 细胞凋亡
　　0引言
　　Survivin基因是继bcl2之后发现的又一重要的凋亡抑制基因，可能是肿瘤治疗的一个分子靶点［1］. 一些体外研究表明抑制survivin的表达或功能可以促进凋亡，抑制肿瘤细胞生长［2-3］，说明survivin可作为抗肿瘤基因治疗的靶点，但在体内抑制survivin是否仍能抑制肿瘤生长，目前尚属未知. 我们通过脂质体(Lip)介导survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides， ASODN)转染胃癌SGC7901细胞，观察survivin ASODN对胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡和对化疗药物白藜芦醇（resveratrol）敏感性的影响如下.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　Lip试剂为Invitrogeo公司产品，Trizol试剂为BBI公司产品. RTPCR试剂盒购自上海生物工程公司，所用兔抗人survivin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，免疫组织化学染色试剂盒（SP即用型），DAB显色剂购自福州迈新生物技术开发公司. 吖啶橙、白藜芦醇购自Sigma公司，胃癌细胞株SGC7901由兰州大学分子生物教研室提供，培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养. 选择对数生长期细胞进行实验. Survivin ASODN序列为5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′，正义寡脱氧核苷酸(SODN)序列为5′CAAGGAGCTGGAAGGCTGGG3′. 两种寡核苷酸均经全硫代修饰、纯化. Survivin上游引物:5′GTGAATTTTTGAAACTGGACAG3′，下游引物： 5′CCTTTCCTAAGACATTGCTAAG3′，扩增产物243 bp；内参照βactin上游引物: 5′CTTCTACAATGAGCTGCGTG3′，下游引物： 5′TCATGAGGTAGTCAGTCAGG3′，扩增产物305 bp. ASODN， SODN及引物均由上海生工合成. 细胞转染按照Lipofectamine TM试剂说明书进行. 用无血清培养基分别溶解ASODN和SODN，将Lip与核苷酸混合于聚苯乙烯试管中，室温下静置30 min后，分别设为ASODN作用组和SODN作用组.
　　1.2方法
　　1.2.1MTT比色法检测
　　细胞毒作用实验分为对照组、Lip组、ASODN+Lip组和SODN+Lip组. 寡核苷酸浓度为100，200，300，400和500 nmol/L. 各组均按每孔5×103细胞数接种96孔板，每组设4个复孔. 分别于转染后24，48，72 h测定570 nm处吸光度(A570)值. 细胞抑制率(%)=(1-A570处理组/A570对照组)×100%，细胞凋亡率(%)=A570处理组/A570对照组×100%. 选择400 nmol/L浓度进行后续实验.
　　1.2.2细胞凋亡的检测
　　转染24 h后每孔取细胞培养液30 μL滴于载玻片上，另加入10 μL吖啶橙，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察细胞形态并拍照. 转染24 h后，收集2×106个细胞，700 mL/L乙醇4℃固定，PBS洗涤2次， Rnase A 37℃消化1 h，碘化丙啶避光孵育10 min，上机检测细胞周期及凋亡细胞所占的比率.
　　1.2.3Survivin表达的检测
　　①survivin mRNA的表达：用Trizol提取细胞总RNA， RTPCR为MMLV一步法. 反应总体系为50 μL，其中细胞总RNA 1 μg，37℃ 30 min合成第一条cDNA链， 94℃预变性2 min，94℃变性15 s， 60℃退火30 s，72℃延伸90 s，共37个循环. βactin退火温度为59℃. ②survivin蛋白的表达：取1 cm2玻片放入6孔板中，然后加入稀释成4×107/L细胞悬液0.5 mL，4 h细胞贴壁后培养过夜，移出玻片后，950 mL/L乙醇固定30 min，将盖玻片移置于载物片上，并在盖玻片细胞面做标记. 采用常规SP法，滴加30 g/L过氧化物酶阻断溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗；滴加非免疫动物血清，室温孵育10 min；倾去血清滴加survivin多克隆抗体（工作浓度为1∶100），4℃过液；室温复温60 min，PBS冲洗；加生物素化二抗，室温孵育10 min，PBS冲洗；加链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶溶液，室温孵育10 min，PBS冲洗；DAB显色，自来水冲洗苏木素复染，中性树胶封片. 用PBS替代一抗作为阴性对照，用已知阳性胃癌切片作为阳性对照.
　　1.2.4Survivin ASODN对SGC7901细胞白藜芦醇敏感性的影响
　　取200 nmol/L ASODN转染后细胞实验， 分为对照组、白藜芦醇(100 μmol/L)组、ASODN(200 nmol/L)组和白藜芦醇(100 μmol/L)+ASODN(200 nmol/L)组(以上均为终浓度). 调整各组细胞数为5×103/孔，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养24 h， MTT法检测细胞毒作用和细胞抑制率.
　　统计学处理： 利用统计软件SPSS 10.0分析，多个样本均数比较采用方差分析，两两比较用SNKq检验；组间方差不齐时采用秩和检验.
　　2结果
　　2.1Survivin ASODN抑制SGC7901细胞的增殖100～500 nmol/L survivin ASODN对胃癌SGC7901细胞的增殖均有抑制作用，呈时间和剂量依赖性，以500 nmol/L抑制率最大，500 nmol/L作用72 h细胞抑制率为79.9%. 400 nmol/L survivin ASODN作用于胃癌SGC7901细胞72h，细胞抑制率为78.4%，与SODN组和Lip组相比均有明显差异(P&<0.05，表1).表1研究因素SGC7901细胞的抑制率作用(略)
　　2.2Survivin ASODN诱导SGC7901细胞的凋亡在荧光显微镜下，对照组细胞形态完整，染色均匀一致，400 nmol/L ASODN处理24 h后， SGC7901细胞呈现典型的凋亡改变(图1). 流式细胞术检测显示，400 nmol/L ASODN作用于SGC7901细胞24h后，凋亡率为(33.6±1.2)%，明显高于SODN组的(10.7±0.8)%和对照组的(1.5±0.6)%，差异均有显著性(P&<0.05).
　　2.3Survivin ASODN下调SGC7901细胞survivin mRNA和蛋白的表达胃癌SGC7901细胞株高表达survivin mRNA. 400 nmol/L ASODN作用于胃癌SGC7901细胞24 h后， survivin mRNA表达明显下调，而对照组和SODN组survivin mRNA水平无明显变化. survivin阳性染色主要在胃癌SGC7901细胞的胞中，少数细胞核中也见survivin阳性染色(图2). 对照组survivin蛋白呈高表达，经ASODN作用后表达水平明显下降.
　　2.4ASODN增加胃癌SGC7901细胞对白藜芦醇的敏感性200 nmol/L ASODN与100 μmol/L白藜芦醇联合作用组SGC7901细胞24，48，72 h生长抑制率，显著高于单用survivin ASODN组(P&<0.05)和单用白藜芦醇组(P&<0.05，表1).
　　3讨论
　　Survivin是近来发现的一种结构特殊的IAP家族蛋白，已被发现于肺癌、前列腺癌、胃肠道肿瘤、淋巴瘤等多种肿瘤组织中，而在成人各正常器官中(除胸腺、胎盘外)检测不到［4］. 作为一种新的抗凋亡因子，survivin在多种肿瘤组织中广泛表达，与肿瘤的发生、发展和预后密切相关，并可能是导致肿瘤细胞耐药性的因素［5-7］. 　　我们观察到，survivin ASODN对SGC7901细胞增殖的抑制作用呈现时间剂量依赖性， 应用流式细胞术检测凋亡细胞，结果表明survivin ASODN能够诱导SGC7901细胞凋亡，400 nmol/L ASODN作用于SGC7901细胞24 h后，凋亡率为33.6%. 我们还通过免疫组化和RTPCR等方法证实SGC7901细胞高表达survivin蛋白及mRNA. 本组结果表明survivin ASODN能够下调SGC7901细胞survivin蛋白及mRNA的表达. ASODN的作用机制可能是mRNADNA复合物激活核糖核酸酶H(RNaseH)导致mRNA降解； mRNADNA复合物抑制mRNA的转录，进而抑制蛋白产物的产生；ASODN与氨酰tRNA竞争mRNA的结合位点，封闭核糖体的阅读作用等.
　　白藜芦醇对多种细胞有很强的抗增生作用，是因其能抑制核糖核苷酸还原酶的活性. Sun等［8］报道，白藜芦醇能抑制DNA多聚酶，也能抑制鸟氨酸脱羧酶(OD，为多种氨基酸合成酶，能促进肿瘤生长). 另外，白藜芦醇通过选择性下调细胞周期蛋白cyclinD1的表达使星状细胞静止在G1期. survivin的表达具有细胞周期依赖性，在细胞周期的G2/M期表达. 在有丝分裂的早期与纺锤体的微管蛋白相连，干扰survivin与微管蛋白的作用可使抗凋亡功能丧失［9-10］. 本研究结果表明survivin ASODN与白藜芦醇联合应用，可显著抑制SGC7901细胞生长，增加其敏感性. 原理可能是survivin ASODN与白藜芦醇二者合用作用于细胞周期的不同环节，抑制肿瘤细胞增殖，增加抗瘤疗效. 二者联合有利于减少单药用量，减少不良反应，克服肿瘤的耐药性. 我们利用已构建的survivin ASODN载体，通过转染转入SGC7901细胞中，可特异封闭survivin基因的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，增加SGC7901细胞对白藜芦醇的敏感性，其作用机制可能与其下调survivin蛋白及mRNA的表达有关. 通过对survivin基因的深入研究，必将有利于肿瘤病机制的阐明，并为肿瘤的诊疗提供一种理想的肿瘤标记物和靶器.

参考文献

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