作者：宋俊玲 杨岚 田琼 袁诚君
【关键词】 血小板因子
关键词: 血小板因子;环磷酰胺;造血干细胞
摘 要:目的 探讨血小板因子4（PF4）对环磷酰胺（CTX）诱导化学损伤小鼠骨髓的保护作用及机制. 方法 环磷酰胺200mg・kg-1 ，腹腔一次性注射，造成药物损伤模型.给CTX前给予PF4预处理，给药后动态观察小鼠外周血白细胞数的变化，并于第5和第8日，分别用流式细胞仪（FCM）测定骨髓有核细胞DNA的含量及细胞周期变化. 结果 注射CTX后4d，外周血白细胞降至最低点，然后逐渐回升，但PF4处理组与单独CTX处理组比较无差异（P&>0.05）.第5日PF4处理组的骨髓有核细胞中，G0 /G1 期细胞的百分率较CTX组明显提高，细胞的坏死、凋亡率下降（P&<0.01），而与PBS对照组基本相同（P&>0.05）.第8日PF4处理组的骨髓有核细胞数较单独CTX处理组增加明显（P&<0.01）. 结论 PF4对CTX损伤的小鼠骨髓细胞有保护作用，可作为肿瘤患者使用烷化剂化疗时的骨髓防护剂.
Keywords:platelet factor;cyclophosphamide;hematopoietic stem cell
Abstract:AIM To provide evidence for studying the chemo-protective effect of PF4and its machanism on murine hematopoietic cells treated with CTX.METHODS The mice were intraperitoneal（IP）injected with PF4（40μg・kg-1 ）twice at6h intervals.20h after the second injection they were given one injection of CTX（200mg・kg-1 ）to make the models of chemical lesions.Then the numbers of their peripheral WBC were observed.5d，8d later the DNA contents in bone marrow cells were detected by flow cyteme-try（FCM）.RESULTS There were no difference between the peripheral WBC counts of PF4treatment groups and the one of CTX groups（P&>0.05）.On day5，bone marrow cells in G0 /G1 phase in PF4treatment groups were significantly higher than that in CTX groups，and the necrotic and apop-totic percentage were significantly lower，but there was no difference between the PF4groups and the PBS control groups.On day8after CTX treatment，bone marrow cellu-larity in PF4treatment groups were significantly higher than that in CTX groups.CONCLUSION PF4can protect murine bone marrow from the cytotoxic effects of CTX.PF4should be a potent protective agent during chemotherapy.
0 引言
骨髓造血系统是对化疗非常敏感的组织，在造血系统恶性肿瘤的治疗过程中，常因骨髓造血抑制而限制化疗药物的剂量，直接影响肿瘤的治疗效果.环磷酰胺（CTX）是肿瘤化疗中最常用的烷化剂，但其对正常骨髓细胞也有很强的抑制作用.此外，作为免疫抑制剂的化疗药物，CTX还是干细胞移植前预处理最常用的药物之一.已有研究表明，血小板因子4（PF4）对5-FU处理的小鼠骨髓有明显的保护作用［1］ .但Han等［2］ 体外实验证明，PF4对HL-60，HEL，SMMC7721及MKN-45等肿瘤细胞株无保护作用.PF4的保护作用与其能可逆性抑制造血干/祖细胞的增殖有关［3］ ，但对烷化剂CTX的作用至今尚未见报道.为进一步探讨PF4对CTX诱导的损伤小鼠骨髓造血干细胞的影响，我们建立了CTX诱导小鼠骨髓损伤的实验动物模型.通过流式细胞仪测定细胞周期的变化，探讨了PF4对造血干细胞的化疗保护作用的机制.
1 材料和方法
1.1 材料 动物:一级BALB/c小鼠36只，雄性，体质量18～20g，鼠龄10～12wk，由第四军医大学实验动物中心提供;药物:PF4购自Sigma公司，系500μg甘氨酸缓冲液冻干品，用5mL三蒸水稀释成工作液，4℃冰箱备用，稀释浓度为100mg・L-1 .CTX由江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号01111221，200mg/支，溶于10mL生理盐水中，稀释浓度为20g・L-1 .
1.2 方法
1.2.1 分组 将36只小鼠随机分为3组，即PF4处理组、单独CTX处理组和PBS对照组，每组12只.PF4处理组:小鼠一次性ip CTX，剂量为200mg・kg-1 ，用CTX前26h和20h各ip PF4，剂量为40μg・kg-1 .单独CTX处理组:CTX用法同上，给CTX前ip等体积的PBS缓冲液.PBS对照组:按上述方法注射等体积的PBS.各组分别于给CTX前及给CTX后2，4，5，6和8d取尾静脉血进行白细胞计数.
1.2.2 制备骨髓有核细胞悬液 给予CTX后第5日及第8日每组小鼠各取6只，以颈椎脱臼法处死.取出股骨，剔除肌肉和结缔组织，剪开股骨两头，用6号针头以RPMI1640液冲出骨髓细胞，再用4号针头过滤制成单个骨髓细胞悬液，检测骨髓有核细胞（bone marrow karyocyte，BMK）数.
1.2.3 样品制备 将上述单个骨髓细胞悬液离心（1000r・min-1 ，5min），弃上清，用PBS洗涤2次，再加入1mL PBS重悬成单细胞悬液，加入2mL无水乙醇，立即混匀，用封口膜封口，放置4℃冰箱冷藏备用.每份样品的细胞数约为（5～10）×105 个.
1.2.4 细胞周期分析 取上述样品，用PBS洗2次，以洗去残留的无水乙醇，加100μL PBS后混匀，用碘化丙锭染色后，以流式细胞仪分析细胞周期及DNA含量的变化.以上实验均重复2次.
统计学处理:数据用x ±s表示，组间比较采用t检验.
2 结果
2.1 PF4对CTX损伤小鼠外周血白细胞的影响 各组小鼠外周血白细胞的动态变化见Fig1.单独用CTX后4d，WBC降至最低点，下降约86.0%，从第5日起开始回升，但与PF4处理组相比较无显著差异 （P&>0.05），表明PF4对CTX化学损伤小鼠白细胞数的下降无明显促进其恢复的作用.
图1 PF4对CTX损伤小鼠白细胞的影响 略
2.2 PF4对CTX损伤小鼠骨髓细胞数的影响 单独用CTX后5d，骨髓细胞数减少约28.0%，8d后有明显上升.PF4处理组与单独CTX处理组相比较，注射CTX后5d骨髓细胞数无明显增加，但第8日增加较明显（P&<0.01，Tab1）.
表1 PF4对CTX损伤小鼠骨髓细胞数的影响 略
2.3 PF4对CTX损伤小鼠骨髓细胞周期的影响 流式细胞仪DNA直方图显示:第5日PF4处理组（Fig2A）经PF4预处理后仅有0.5%发生坏死、凋亡，而单独CTX处理组（Fig2B）细胞的G0 /G1 峰前出现荧光强度较低的坏死、凋亡峰，约占12.6%，CTX组与PBS对照组（Fig2C）及PF4处理组相比差异均有显著性（P&<0.01）.细胞周期分布分析显示，PBS对照组正常骨髓细胞多数处于G0 /G1 期，S期次之，G2 /M期最少，CTX组的细胞周期发生变化，G0 /G1 期细胞占75.7%，而PF4处理组G0 /G1 期比例占82.1%，较单独CTX处理组明显增多，差异有显著性（P&<0.01）.第8日（Fig2D为CTX组）3个组比较G0 /G1 期比例无明显差异（P&>0.05）.
3 讨论
PF4是激活的血小板α颗粒释放的特异蛋白，属于CXC类趋化因子，除与炎症有关外［4，5］ ，与多种细胞的生物功能均有着密切联系，其中与造血和肿瘤的关系日益受到重视，包括抑制血管新生［6，7］ 、抑制内皮细胞增殖［8］ 及以依赖和不依赖肝素两种途径抑制造血干/祖细胞的增殖［9-11］ .因此，PF4又属于造血负调控因子［12，13］ .已有研究表明，PF4对早期造血干/祖细胞尤其早期巨核细胞的增殖、分化有抑制作用，其抑制巨核细胞集落形成的作用是可逆的，停用PF4后巨核细胞即恢复增殖活性，从而对造血干细胞起到了保护作用［1，3，14］ .环磷酰胺是肿瘤化疗最常用的烷化剂，通过与DNA交叉联结，而直接破坏DNA，其疗效高低与血药浓度成正比.除对G0 期（静止期）细胞作用较弱外，对增殖周期中各期细胞均有破坏作用，还可致染色体畸变、突变而影响分裂，引起造血细胞的坏死、凋亡［15，16］ .本实验显示，200mg・kg-1 环磷酰胺可引起骨髓细胞坏死、凋亡，第5日比例达12.6%，与正常对照组相比，差异有显著性;经PF4预处理后其坏死、凋亡率明显下降，而G0 /G1 期细胞相对增多，与环磷酰胺组相比差异有显著性，表明PF4可降低造血干细胞对化疗药物的敏感性，避免环磷酰胺诱导的凋亡、坏死，从而保护造血干细胞.但第8日PF4处理组与对照组比较G0 /G
1 期比例无明显差异（P&>0.05），进一步证实了PF4对造血干细胞的抑制作用是短暂、可逆的.
图2 PF4影响CTX损伤小鼠BMK细胞周期分布的FCM分析 略
关于PF4这种保护作用的机制还不十分明确.本实验证实，PF4可阻止G0 /G1 期细胞进入S期，从而使G0 期（静止期）细胞增多，可避免受细胞毒药物的损害.用PF4预处理后其骨髓细胞总数增加，尤其是可提高骨髓造血干/祖细胞静止期的数量，这样根据一定的化疗药物杀伤恒定数目的骨髓造血干/祖细胞［15］ ，故化疗后活存的造血干/祖细胞绝对值增多，有利于造血功能的重建.Han等［2］ 研究显示，转化生长因子β1（TGFβ1）、足叶乙甙单用或与PF4联用相比，与PF4联用组凋亡细胞明显减少，表明PF4可避免细胞毒药物和转化生长因子（TGFβ1）诱导的凋亡，与本实验相符.结合文献，其干扰细胞周期的分子机制可能是通过阻止P21Cip1/WAF1 下调，进而抑制CyclinE-cdk2的活动，并使视网膜胚细胞瘤蛋白（PRb）磷酸化减弱，引起G0 /G1 期阻滞［8］ .有趣的是，PF4仅对正常造血干细胞起这种作用，因而可以避免化疗的细胞毒作用而诱发正常细胞的凋亡，而对白血病细胞和非造血系统瘤细胞则无以上作用［2］ ，提示PF4在肿瘤治疗方面的巨大临床应用潜力.
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