作者：任杰 常耀明 李金声 刘立
【关键词】 高压氧
关键词: 高压氧;弥漫性轴索损伤;记忆;海马;胆碱O-乙酰转移酶;大鼠
摘 要:目的 研究高压氧（HBO）治疗对弥漫性轴突损伤大鼠学习记忆功能的影响. 方法 采用Marmarou介绍的落体打击装置制作弥漫性轴突损伤（DAI）大鼠模型，一组大鼠在致伤前进行Y型迷宫训练，另一组不预先训练，分别观察高压氧治疗对致伤大鼠迷宫空间辨别记忆及学习功能的影响，并用免疫组化的方法观察海马区ChAT阳性纤维表达变化. 结果 无论是否进行Y迷宫训练，损伤大鼠条件反射数（con-ditioned reflex number，CN）明显高于空白对照组（blank）大鼠（P&<0.05）;预先Y迷宫训练后的大鼠造成DAI损伤后，HBO组与对照组（control）相比CN次数无明显差别;未预先训练组中HBO治疗大鼠CN次数明显少于对照组（P&<0.05）;HBO治疗后损伤大鼠海马区ChAT阳性纤维表达显著增强. 结论 弥漫性脑损伤后大鼠的学习能力和记忆力均下降，而高压氧治疗能改善脑损伤大鼠学习障碍，但对记忆障碍的影响不大;高压氧治疗能增强海马区神经元活性，抑制外伤后ACh能神经元发生的退行性变，这可能是高压氧改善脑损伤大鼠学习记忆障碍的机制之一.
Keywords:hyperbaric oxygen ation;diffuse axonl injury;memory;hippocampus;choline O-acetyltrans-ferase;rats
Abstract:AIM To investigate the effects of hyperbaric oxy-gen（HBO）treatment on Sprague-Dawley rats’ability of learning and memory after diffuse axonal injury（DAI）.METHODS The head-injured animal models were produced by an weight-dropt device designed by Marmarou.Rats were randomly pided into4groups.Rats in group A were trained in Y-maze for7d before impact injury and those in group B were not trained before injury.The conditioned reflex num-ber（CN）after HBO therapy in two groups was measured with the establishment of injured and blank controls，The samples of each rat’s brain in group C and group D were tak-en to do the choline-acetyltransferase（ChAT）immunohis-tochemical staining and were examined under light micro┐scope.RESULTS CN of DAI rats was greater than that of blank control group;the difference of CN was not statistical-ly significant between HBO group and control group in group A;while in group B，CN of HBO group was significantly less than that of injured group;the ChAT-positive fibers in hip-pocampus almost vanished after DAI and the positive fiber were markedly increased after HBO.CONCLUSION The a-bility of learning and memory of rats might be decreased after DAI.HBO could improve learning ability of the injured rats.HBO also could activate neurons in hippocampus and inhibit regression of cholinergic neurons，which may be one of the mechanisms of improvement of the learning ability of injuried rats by HBO.
0 引言
颅脑损伤，特别是重型颅脑损伤患者往往遗留不同程度的神经精神症状和智力障碍，给家庭及社会带来巨大的负担，甚至造成危害.经临床验证，高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）治疗对颅脑损伤、脑缺血、脑卒中的恢复有较好疗效.由于临床研究的复杂性及难控制性，我们以大鼠为对象探讨高压氧治疗脑损伤所致学习记忆障碍的作用及机制.
1 材料和方法
1.1 材料 选用第四军医大学实验动物中心提供的健康成年雄性4mo龄SD大鼠50只，体质量350～380g.随机分为A，B，C，D4组，其中A组20只;B组13只;C组12只;D组5只，所有动物实验均严格按照有关实验室动物照料及使用规则进行.
1.2 方法
1.2.1 动物模型制备 采用Marmarou等［1］ 介绍的动物损伤方法制作弥漫性轴突损伤（diffuse axonal injury，DAI）模型.用质量为450g的物体，从150cm高度自由落下打击大鼠头部致伤.打击时用速眠新合剂腹腔麻醉，将大鼠置于厚海绵床上，用牙胶将一块直径10mm、厚3mm的钢板固定在大鼠的颅骨穹隆部，使大鼠头部在打击后沿外力作用向前运动并避免颅脑局限性损伤.
1.2.2 Y-迷宫学习记忆训练及测试 Y迷宫［2］ 由第四军医大学预防医学系防原教研室提供，为三个互相连通的等分Y型辐射式迷宫.迷宫臂长30cm，高15cm，宽15cm，每臂末端有15W信号灯，箱底各铜栅间隔4mm.测试方法:Y迷宫每臂顶端的信号灯提示是否安全，明臂为安全区，其余两臂为危险区，灯亮后5s，两暗臂通以40V交流电，刺激大鼠由暗臂跑至明臂.训练中始终有一臂为安全区，安全区按Ⅰ-Ⅱ-Ⅲ-Ⅰ的顺序每隔1min进行交换，实验在安静、光线较暗处进行.实验时先使大鼠在迷宫中适应5min，予以电击，如果大鼠受电击后从暗臂区逃至安全区为“正确反应”，如果大鼠受电击后从一暗臂区逃至另一暗臂区为“错误反应”，连续10次电击正确反应9次以上为达标，记录达标时发生的错误次数即条件反射形成的次数（conditioned reflex number，CN）.大鼠首次进行Y迷宫训练时的CN反映其学习获得能力，训练7d（2次・d-1 ）并休息24h以上测试的CN反映其记忆力.
1.2.3 高压氧治疗 大鼠致伤6h后行高压氧治疗.使用DWC450-1150型动物实验舱，先以医用氧加压至0.12MPa（1.2ATA），连续洗舱8min，使氧浓度达90%以上，再用15min加压至0.2MPa，稳压60min，而后用20min减压，每次共103min，1次・d-1 ，连续7d.
1.2.4 各组动物处理 A组观察HBO治疗对大鼠 记忆能力的影响，先进行Y迷宫训练7d，使之形成稳定条件反射（即形成记忆），而后造成外伤，剔除3只对电流不敏感的大鼠，17只大鼠中5只设为对照组（Control1 ），余12只制作DAI模型（1只死亡），损伤组（Injured1 ，6只）、治疗组（HBO 1 、5只）及对照组均于伤后7d重新行Y迷宫测试，记录CN.B组观察HBO治疗对大鼠学习能力的影响，13只大鼠先致伤（1只死亡），6只行HBO治疗，损伤组（Injured2 ，6只）及治疗组（HBO2 ，6只）均于伤后7d行Y迷宫训练测试，并将对电流不敏感的1只大鼠剔除，A组大鼠首次训练时的成绩作为B组中对照组（Control2 ，17只）数据.为排除Y迷宫训练对中枢神经递质的干扰，经Y迷宫训练过的大鼠不进行免疫组化染色，故仅对C组和D组大鼠进行病理学检查和免疫组织化学染色.C组12只造成外伤模型（1只死亡，6只行HBO治疗，另外5只未做治疗）和D组空白对照组（Blank）5只进行免疫组化染色，观察海马区胆碱乙酰转移酶（ChAT）纤维染色变化.
1.2.5 标本制作 将大鼠用20g・L-1 戊巴比妥钠（60mg・kg-1 ）腹腔麻醉后，开胸暴露心脏，插管，由左心室经主动脉快速灌注生理盐水200mL，40mL・L-1 多聚甲醛-0.1mol・L-1 PBS400mL，断头取脑，再置于多聚甲醛中浸泡6h，根据大鼠脑定位图谱选取冠状切面（Bregma-4.16mm）皮层、海马、下丘脑平面，按常规制成厚约5μm石蜡切片，并行HE染色.
1.2.6 免疫组化染色 石蜡切片常规脱蜡至水后，对抗原进行修复（切片置于pH6.0，0.01mol・L-1 柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液于水浴锅中95℃30min行热修复），自然冷却，0.01mol・L-1 KPBS洗涤，分别加入一抗ChAT（1∶3000）6h，二抗IgG（1∶300）2h，ABC（1∶300）2h（一抗、二抗及ABC均购自武汉博士德公司），DAB呈色，苏木素轻度复染1min，脱水透明，中性树脂封固，KPBS代替一抗作阴性对照.
统计学处理:用本校SPLM统计软件，对各组动物Y-迷宫训练成绩进行方差分析.
2 结果
2.1 动物行为 受打击的动物，伤后即刻出现呼吸暂停数秒，31只动物出现持续数秒的轻度全身抽搐，有的伴有去皮层综合征（表现为双侧前肢屈曲，双侧后肢强直，颈项强直等）.经辅助呼吸后多数可恢复规则的自主呼吸.与对照动物相比，麻醉恢复要迟十几分钟至半小时.3只大鼠于打击后出现持续呼吸抑制和全身抽搐，十余秒钟后呼吸停止，死亡.
2.3 免疫组化 空白对照组中海马结构内含有大量ChAT阳性染色纤维，其排列均匀细致，表面光滑.损伤组中ChAT阳性纤维明显减少，几乎不见正常形态的纤维.HBO组ChAT阳性纤维明显增多，纤维较粗大，排列紊乱不如空白对照组规则（Fig4～6）.
图1 －图6 略
2.4 Y┐迷宫训练 无论是否预先进行Y迷宫训练，损伤大鼠条件反射数（conditioned reflex number，CN）明显高于对照组大鼠（P&<0.05）;预先Y迷宫训练的大鼠损伤后，无论HBO治疗与否，CN次数无明显差异;而未预先训练的大鼠损伤后，HBO治疗与未治疗存在显著差异（P&<0.05，Tab1）.
表1 大鼠Y-迷宫训练成绩 略
3 讨论
颅脑外伤发生率高，致死率、致残率高，是严重危害人民群众健康的一种疾病.颅脑损伤主要与暴力作用部位.大小、速度和挤压的程度有关，近年来一些临床和病理学者倾向于将脑损伤分为局灶性和弥漫性两种［3］ ，前者包括脑挫裂伤、颅内血肿和由于脑移位、扭转或颅内压增高造成的脑损害，后者包括DAI、弥漫性脑肿胀和缺氧性脑损害等，而DAI对颅脑损伤患者的病情发展特别是伤后功能恢复有很大影响.典型的DAI病理表现包括［4］ :①胼胝体的局灶性损伤;②一侧或两侧脑干上部背外侧1/4的局灶性损伤，并常累及小脑上脚或大脑脚;③弥漫的白质轴索损伤.Gennarelli等［5］ 用猴角加速度损伤模型较好的模拟了人的轴突损伤的表现，但模型制作复杂，费用昂贵.本实验采用的Marmarou模型是公认的一种较好的轴突损伤动物模型，可以较好的模拟DAI的病理表现，简便实用.
Y-迷宫实验是目前公认的一种简便的测量动物学习记忆能力的方法.本实验通过测量大鼠在灯亮时未跑到安全区的错误次数来表示条件反射形成的次数，大鼠首次Y迷宫测试的成绩反映其学习能力，在连续训练7d后并间隔7d再测试的成绩反映其记忆能力.我们通过制作Marmarou模型，观察到大鼠损伤后出现学习和记忆功能障碍，与文献报道一致，予以高压氧治疗后可明显提高损伤大鼠的学习能力，但改善其记忆障碍效果不明显，和临床应用高压氧治 疗脑外伤患者可明显改善记忆障碍有所不符，其机制尚待进一步研究.
胆碱能系统在睡眠、情感、学习、记忆等高级神经活动中起着重要的作用，该系统受损时可以引起认识和记忆缺陷，产生痴呆症状.破坏大脑皮质及海马的胆碱能纤维投射，动物的行为和学习、记忆能力受到明显损害［6］ .脑内胆碱能纤维主要源于前额叶的胆碱能神经元，经穹隆投射到海马.乙酰胆碱（ACh）是中枢神经系统内的一种重要的神经递质，由乙酰辅酶A（AcCoA）及胆碱在ChAT催化下完成.ChAT在神经元胞体中合成，经轴浆运输到神经末梢.本实验对损伤大鼠进行ChAT免疫组化染色，发现大鼠损伤后7d海马区脑组织ChAT阳性纤维明显减少，几乎不见正常形态的纤维，与Jiang等［7］ 发现一致，而HBO组ChAT阳性纤维明显增多.
HBO能提高组织的氧含量和氧的有效弥散距离，改善脑的代谢，并且能降低颅内压，在救治脑外伤中有其独特的作用.近年来的研究还表明，HBO能加速脑缺血狗的神经系统功能恢复［8］ ，并明显改善脑缺氧小鼠的学习记忆功能［9］ .此外，HBO对脑外伤后的神经功能保护可能与下列因素有关:①HBO抑制脑组织损伤后内源性毒性产物的生成，如氧自由基、一氧化氮［10，11］ ，避免或减轻了自由基对神经细胞膜及其它生物膜的损害;②HBO减轻缺血细胞膜上的离子泵损伤［9］ ，使细胞内外的离子分布趋于正常状态，保持细胞膜的稳定.HBO可通过上述机制保护脑组织，抑制Ach能神经元的退行性变，从而使损伤大鼠海马区ChAT阳性纤维增生，这可能是高压氧治疗改善颅脑损伤患者学习记忆功能障碍的原因.
参考文献:
［1］Marmarou A，Foda Ma，Van den Brink W，Campbell J，Kita H，Demetriadou K.A new model of diffuse brain injury in rats.Part I:Pathophysiology and biomechanics ［J］.J Neurosurg，1994;90:291-300.
［2］Song GP，Miao DM，Huang FE，Chen ZH，Feng XW.Effects of sleep deprivation on rats’behavior and learning ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（6）:663-665.
［3］Gennarelli TA.Mechanisms of brain injury ［J］.J Emerg Med，1993;11:5-11.
［4］Adams JH，Doyle D，Ford I.Diffuse axonal injury:Definition，diagnosis and grading ［J］.Histopathology，1989;15:49-59.
［5］Gennarelli TA，Thibault Le，Adams JH.Diffuse axonal injury and traumatic coma in the primate ［J］.Ann Neurol，1982;12:564-574.
［6］Bartus RT.The cholinergic hypothesis of geriatric memory dys-function ［J］.Science，1982;217:408-412.
［7］Jiang JL，Xu BN，Duan GS，Zhou DB，Li BM.Experimental study on the changes of cholinergic fibers in diffuse axonal in-jury ［J］.Zhonghua Shenjing WaikeZazhi（Chin J Neurosurg），2001;17:155-157.
［8］Takahashi M，Iwatsukiki N，Ono K.Hyperbaric oxygen thera-py accelerates neurologic recovery after15-minute complete global cerebral ischemia in dogs ［J］.Crit Care Med，1992;20:1588-1594.
［9］Liu SX，Wang HL，Xie W.Effects of hyperbaric oxygen on learning and memory function of experimental hypoxia mice ［J］.Zhongfeng yu Shenjing Jibing Zazhi（J Apoplexy Nerv Dis），1996;13:152-153.
［10］Neubauer RA，Gottlieb SF.Hyperbaric oxygen for brain injury ［J］.J Neurosurg，1993;78:687-688.
［11］You C，Hu BC，Zhou SB，Shen JK，Li GW.Effects of hyper-baric oxygen on nitric oxygen and cerebral edema after traumatic brain injury ［J］.Zhonghua Liliao Zazhi（Chin J Phys Ther），1997;20:67-71.
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