【关键词】 脑膜脑炎
关键词: 隐球菌，新型;脑膜脑炎;聚合酶链反应;墨汁复染;真菌培养
摘 要:目的 探讨聚合酶链反应（PCR）在新型隐球菌脑膜脑炎快速诊断的临床价值. 方法 应用聚合酶链反应检测50例临床脑脊液标本中的新型隐球菌，同时用直接涂片墨汁复染、真菌培养进行对比检测. 结果 在50例患者临床脑脊液标本中，PCR检测阳性11例;直接涂片墨汁复染阳性7例阳性;真菌培养阳性9例. 结论 用PCR方法具有简便、快速、特异、敏感的特点，从脑脊液标本中直接检测新型隐球菌，提供病原学诊断依据，对新型隐球菌脑膜脑炎的快速诊断具有重要的临床意义.
Keywords:cryptococcus neoformans;meningoencephalitis;polymerase chain reaction;Chinese ink smear;fungal culture
Abstract:AIM To evaluate the clinic value of polymerase chain reaction（PCR）in the diagnosis of cryptococcus neofor-mans meningoencephalitis.METHODS PCR，Chinese ink smear and fungal culture were used respectively in the detec-tion of cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid of50
patients.RESULTS Among the cerebrospinal fluid of the50cases，11cases were positive by PCR，7cases by Chinese ink smear detection，and9cases by fungal culture.CONCLU┐SION As a new method of molecular biology，the PCR de-tection can be used in the quick diagnosis of cryptococcus neo-formans meningoencephalitis by cerebrospinal fluid.This PCR-based detection and identification provides a rapid labo-ratory method for the diagnosis of cryptococcus neoformans meningoencephalitis and shows its potential value for clinical applications.
0 引言
隐球菌病是一种由新型隐球菌所引起的人兽共患性疾病，各种哺乳动物均可为该菌的常见宿主，病原菌是新型隐球菌，鸽子是人类的主要感染源，在人类感染中有嗜中枢神经系统的倾向.免疫机能正常（细胞免疫为主）可阻止发病.近年来由于抗生素和肾上腺皮质类固醇的广泛应用，新型隐球菌性脑膜脑炎的发病率呈逐年升高的趋势.目前对该病的诊断主要依据脑脊液直接涂片墨汁复染及真菌培养两种方法，但由于前者阳性率较低，而后者所需时间较长，使得许多患者失去了抢救的机会.聚合酶链反应（PCR）诊断技术，由于具有操作简便、准确率高的特点，为快速诊断新型隐球菌脑膜炎提供了可能.本研究中，我们以新型隐球菌全基因序列选择高度特异的保守区基因为引物，采用PCR技术快速检测脑脊液中的新型隐球菌，并与直接涂片墨汁复染、真菌培养和结合临床诊断隐球菌性脑膜脑炎的方法进行比较，以探讨PCR技术快速检测脑脊液中的新型隐球菌在临床快速诊断隐球菌性脑膜脑炎中的价值和意义.
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本源 脑脊液标本50例，均为临床疑诊为隐球菌脑膜脑炎的住院患者，具有脑膜脑炎的症状、体征和脑脊液改变.其中男性33例，女性27例，年龄12～64（平均39.8）岁.本组50例患者中有接触鸽子史者2例;有程度不等的头痛者48例，头疼多为持续性;有恶心、呕吐者44例，均为喷射性呕吐;低至中度发热者43例，高热者7例;神志障碍及精神症状者17例;癫痫发作者8例，病程中出现偏瘫者6例，巴彬斯基征阳性23例.所有患者查体均脑膜刺激征阳性，另45例患者眼底视乳头水肿.全部患者脑脊液压力均升高，脑脊液外观无色透明者23例，微混浊4例，白细胞数正常9例.头部CT检查示颅内片状低密度灶5例，侧脑室扩大16例.
1.1.2 新型隐球菌特异性引物序列的设计与合成［1］ 根据goldkeY数据库中新型隐球菌全基因序列分析，选取URA保守序列，扩增片段为:426bp，由上海生工生化工程公司合成.Taq DNA酶、4×dNTP购自华美生物工程公司;墨汁为优质印度墨汁;沙氏真菌培养基为西京医院检验科细菌室制备.
1.2 方法
1.2.1 脑脊液标本模板DNA的提取 取脑脊液200μL，7000g离心5min，弃上清，沉淀中加碱性裂解液（2mmol・L-1 NaOH，1g・L-1 吐温-20，1g・L-1 TeetwoX100，1g・L-1 NP-40）98℃10min，7000g离心5min，取上清做模板.
1.2.2 PCR扩增 反应总体积为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL，4×dNTP1.5μL，引物各0.25μL，无菌去离子水9.5μL，模板10μL，Taq DNA聚合酶IU・μL-1 ，以无菌石蜡油30μL覆盖，进入PCR循环，循环参数为:95℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1min，32个循环，最后72℃延伸5min.PCR扩增产物用2g・L-1 琼脂糖凝胶（含EB）电泳100V，30min，紫外灯下观察结果，出现特异性条带者为阳性.
1.2.3 直接涂片墨汁复染 将脑脊液7000g离心5min，弃上清，取沉淀制片，滴加墨汁复染3～5min，显微镜观察.
1.2.4 真菌培养 取脑脊液于沙氏肉汤中37℃（24h）增菌培养，转种于血液琼脂平板上37℃培养24h，待菌落生长后，然后进行涂片、生化鉴定.
2 结果
本组50例患者临床最后诊断为新型隐球菌脑膜脑炎11例，结核性脑膜炎15例，病毒性脑膜炎及其他24例.50例患者死亡2例，余48例经治疗临床症状均有不同程度的恢复.在50例脑脊液标本中检测新型隐球菌:应用PCR技术阳性11例22%（Fig1），直接涂片墨汁复染阳性7例14%（Fig2），真菌培养阳性9例（18%）.3种检测方法结果比较，无统计学 差异.其临床符合率分别为:PCR技术90.9%，直接涂片墨汁复染63.3%、真菌培养81.8%;PCR的假阳性2.0%.11例PCR阳性标本中，包括7例直接涂片墨汁复染阳性和9例真菌培养阳性的标本，未见直接涂片墨汁复染和真菌培养阳性而PCR阴性者.
图1 － 图2 略
3 讨论
近年来，由于大量抗生素、激素或免疫抑制剂的应用，新型隐球菌在临床上的感染有明显增加的趋势.新型隐球菌感染一般为外源性，也有少部分为内源性.新型隐球菌感染发生时，病原体往往由肺部经血而进入中枢神经系统，导致隐球菌性脑膜脑炎的发生.隐球菌性脑膜脑炎病情一般较严重，其临床表现与许多中枢神经系统感染性疾病特别是与结核性脑膜脑炎的临床表现十分相似，其误诊率甚至可高达50%以上.因此，隐球菌性脑膜脑炎患者往往被延误诊治，出现多种并发症与后遗症，甚至死亡. 转贴于 隐球菌性脑膜脑炎确诊的惟一依据是脑脊液的病原学检查，以往主要采用直接涂片墨汁染色或真菌培养法对脑脊液进行病原学检查.国内曾报道［4］ 隐球菌性脑膜脑炎患者脑脊液直接涂片墨汁染色阳性率可达到54%～74%，真菌培养阳性率可达到95%，与本组病例中直接涂片墨汁复染准确率63.3%，真菌培养准确率81.8%的结果基本一致.但在临床实践中，直接涂片墨汁染色法虽然简便、快速，但阳性率低;而真菌培养虽然可以提高阳性率，但也存在培养时间长的缺陷.目前本病治疗效果欠佳、病死率较高很大程度上与不能及时、准确的诊断有关［5，6］ .为此，快速、准确实验室诊断方法对诊断脑膜脑炎尤为重要.
随着临床分子生物学技术的发展和应用，近年来PCR技术已经发展成为一种较为成熟、敏感的临床快速诊断方法［7］ .应用PCR技术可以为感染疾病、遗传性疾病等的诊断提供准确的诊断依据.对于本组脑脊液标本，我们以新型隐球菌全基因序列选择高度特异的保守区基因为引物，采用PCR技术快速检测脑脊液中的新型隐球菌，并同时使用直接涂片墨汁复染、真菌培养的方法结合临床诊断，验证PCR技术在新型隐球菌性脑膜脑炎诊断中的应用价值.结果显示PCR，直接涂片墨汁复染和真菌培养的阳性检出率均较低，但PCR阳性检出结果与临床诊断符合率较高.通过本组脑脊液标本的检测结果进行分析，我们认为PCR技术检测新型隐球菌，用于新型隐球菌脑膜炎的诊断，不论在阳性检出率，还是临床诊断符合率，均明显优于直接涂片墨汁复染和真菌培养，同时，由于PCR还具有检测周期短、操作简便的优点.因此，虽然其存在一定的假阳性（2%），但聚合酶链反应作为一种新的分子生物学方法，对新型隐球菌脑膜脑炎的快速、准确诊断具有重要的临床价值，对新型隐球菌脑膜脑炎的治疗和预后具有重要的影响.
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