作者：艾玉峰 柳大烈 熊猛 郭树忠
【关键词】 成骨细胞
关键词: 生物医学工程;聚羟基乙酸;成骨细胞;胶原;骨形态发生蛋白质类
摘 要:目的 探讨组织工程化骨修复兔颅骨缺损的实用价值及合理应用BMP的方法. 方法 将自体成骨样细胞即刻种植在复合BMP的胶原包埋的聚羟基乙酸（PGA）的基质材料和不含BMP的基质材料上，然后将不同的复合体或单纯基质材料移植到兔颅骨的一侧全层骨缺损区，作为实验侧I、实验侧Ⅱ或实验侧Ⅲ.对侧设对照，不作任何植入.将60只新西兰兔分别于术后2，6，8及12wk处死，标本行大体组织学检查，X线摄片及灰量测定检查. 结果 表明实验侧I成骨量明显大于实验侧Ⅱ或实验侧Ⅲ（P&<0.01），而对照侧仅为纤维组织修复. 结论 组织工程骨可修复自体的兔颅骨缺损，应用外源性BMP可促进骨再生，为组织工程化骨在颅面外科及整形外科领域的临床应用奠定了基础.
Keywords:biomedical engineering;polyglycolic acid;os-teoblasts;collagen;bone morphogenetic proteins
Abstract:AIM To explore the practical value of repairing the defects of rabbit calvarial with tissue engineering tech-nique and the way of rational application of BMP.METHODS The osteoblast-like cells were instantly implanted onto the BMP compounded polyglycolic acid（PGA）matrix coated with collagen and pure PGA matrix coated with collagen.60NewZealand rabbits were pided into three groups random-ly.In Group One，the composite of osteoblast-like cells and PGA matrix with BMP was grafted into the defect on one side of the skull，leaving the same defect area on the other side as controls without any graft implanted.In Group Two，cells+PGA were grafted in the same way as Group One.In the third group，only PGA was grafted in the same way as Group One.The rabbits were killed respectively on the2nd，6th，8th and the12th week.The macroscopic examination，histol-ogy，x-ray and measurement of the ash weight of the im-plants were performed.RESULTS Osteogenesis of group One was better than those of Group Two，Group Three and the control sides（P&<0.01），and there was only fibrous tis-sue on the control sides.CONCLUSION Exogenous BMP can accelerate bone reconstruction，indicating that Tissue-en-gineered bone could be clinically used in craniofacial and or-thopedic surgery.
0 引言
1987年美国科学基金会提出组织工程概念，国内外组织工程研究取得令人注目的阶段性研究成果.应用组织工程骨修复骨缺损将成为可能，BMP作为骨再生的诱导因子已被证实，研究应用BMP的方式和方法是骨组织工程研究的一个热点.我们将组织工程骨与外源性BMP复合，在修复兔颅骨缺损的研究中取得了较满意的实验结果.
1 材料和方法
1.1 材料 新西兰兔60只，3～4mo龄，体质量2.0～2.5kg，雌雄不限（第四军医大学西京医院动物实验外科提供）.取864合剂（0.3mL kg-1 ）im麻醉动物，无菌条件下暴露颅盖顶骨，用骨凿在顶骨两侧各造成约1.5cm×1.0cm的近长方形全层骨缺损模型［1］ .随机各取20只兔分为3个实验组，每只颅盖顶骨两侧各造1个全层骨缺损.右侧为实验侧，属于实验组1的为实验侧Ⅰ，属于实验组2的为实验侧Ⅱ，属于实验组3的为实验侧Ⅲ，每实验组另一侧作为对照.
1.2 方法
1.2.1 聚羟基乙酸基质材料的包埋 将直径15μm聚羟基乙酸（polyglycolic acid，PGA）纤维无纺网（Davis-Geck公司）以0.6mL L-1 戊二醛交联后的骨胶原包埋固定，得交联胶原包埋PGA基质材料.材料消毒采用750mL L-1 乙醇浸泡及紫外线照射.
1.2.2 BMP复合基质材料的制备 将小牛的BMP（第四军医大学西京医院骨科研究所提供）溶于1mL4mol L-1 GuHCl/0.05mol L-1 CaCl2 复合液，将20份胶原包埋PGA的基质材料放入溶好的BMP稀释液中，然后用蒸馏水透析48h，冻干，环氧乙烷消毒，真空中清除气体备用.每份材料中含bBMP3mg.
1.2.3 成骨样细胞的分离 将实验组1和实验组2的新西兰兔所取的自体颅骨组织分别机械粉碎至1mm×1mm×1mm的骨片，以PBS缓冲液冲洗2遍.然后加入2倍于骨体积的I型胶原酶（sigma公司，1mg mL-1 ）在37°C恒温水浴消化90min，经过滤、漂洗，制成细胞悬液，细胞计数浓度为3.35×107 个 mL-1 .
1.2.4 成骨样细胞移植 各取50μL的自体成骨样细胞即刻种植在复合BMP的胶原包埋的聚羟基乙酸（PGA）的基质材料上，并将各复合体移植到实验侧I，将不含BMP的基质材料复合体移植到实验侧Ⅱ的自体骨缺损区，实验侧Ⅲ的骨缺损区仅植入单纯PGA基质材料;对照侧均不作任何植入.创面皮肤逐层缝合.术后肌注20万u青霉素，分笼饲养.
1.2.5 检测项目 ①组织学检查:实验组（1，2，3）分别于术后2，6，8及12wk处死取材，标本用100mL L-1 甲醛固定24h，脱钙，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，组织切片作HE染色.②X线摄片及大体标本检查，实验组（1，2，3）于术后8wk处死的实验兔，取下颅盖骨摄X线片及大体标本摄影.③灰量测定，按文献报道方法［2］ 取下植入材料和周围骨块烧灰称重.统计学处理:所测数据用第四军医大学统计学教研室开发的SPLM统计分析软件处理，数值用x ±s表示，并经方差分析及最小显著差法比较.
2 结果
本组实验兔全部存活，切口均一期愈合.
2.1 显微镜观察 术后2wk，膜内成骨活跃，骨端新生骨小梁基本覆盖骨断端，实验侧Ⅱ缺损区可见较多新生骨小梁形成，实验侧Ⅲ骨端新生骨小梁向缺损 区长入，术后6及8wk实验侧Ⅱ缺损区可见较多散在骨岛形成，实验侧Ⅰ的成骨量明显优于实验侧Ⅱ;实验侧Ⅲ缺损区可见大量纤维组织及毛细血管长入，植入的基质材料基本被吸收，术后12wk实验侧I可见成熟骨，并有髓腔形成（Fig1）.实验侧Ⅱ缺损区大量新骨形成（Fig2），实验侧Ⅲ仅骨断端处有散在骨岛，对照侧缺损区被增生的纤维结缔组织占据，无新骨生成.
2.2 X线摄片及大体标本检查 术后8wk，实验侧Ⅰ缺损基本被修复（Fig3），实验Ⅱ侧缺损大部份被修复（Fig4），密度较对照侧高（Fig5），实验侧Ⅲ仅少部分被修复.
2.3 实验侧（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）缺损区内移植体及缺损区周围骨块的灰重测定结果 见Tab1.
表1 实验侧（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）颅骨缺损区的灰重 略
3 讨论
在骨组织工程技术应用中，构建组织工程化人工骨应以成骨细胞为中心，成骨细胞来源的选择是一个重要问题［3］ .以往研究的种子细胞通常是经过体外培养传代繁殖所获得，具有细胞分化易定向，植入机体后可保持成骨活性等优点.但在细胞培养过程中无法避免培养程序复杂，多次传代后活性降低，易受细菌污染等弊端.目前许多研究者主张组织工程中细胞培养与扩增应当是三维的，且采用低重力效应下的三维培养技术，实验结果证明这种条件下细胞的生物活性较高.因此，应重视在与生理环境类似条件下的组织工程细胞培养［4］ ，研究在机体环境下组织再生无疑是非常有前途的研究方向.
图1 －图5 略
组织工程学研究仅有10余年的研究历史，我们在骨组织工程方面进行了一系列的研究，但仍有很多科学问题尚需深入研究，如BMP使用的最优浓度及其它生长因子的研究、组织工程细胞的可靠来源问题、支架材料的降解与细胞功能的同步化等.因此正确认识目前组织工程研究中存在的各种障碍，对未来的组织工程研究将起到积极的促进作用，组织工程化骨也将成为最有希望进入临床应用的组织工程成果之一［10］ .
参考文献:
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