【关键词】 C型肝炎样病毒属
关键词: C型肝炎样病毒属;基因型;多态性，限制性片段长度
摘 要:目的 了解西安和郑州地区丙型肝炎病毒（HCV）感染的基因型，比较两地基因型分布的差异. 方法 采用限制性长度多态性分析（RFLP）法对采自西安地区的46份和郑州地区的40份HCVRNA阳性标本进行HCV基因型分型研究. 结果 西安地区46份标本中，25份（54.3%）为1b型病毒，17份（37.0%）为2a型病毒，4份（8.7%）为1b/2a混合型病毒;郑州地区40份标本中，19份（47.5%）为1b型，13份（32.5%）为2a型，3份（7.5%）为1a型，4份（10.0%）为1b/2a混合型病毒，1份（2.5%）为1a/1b混合型病毒. 结论 两地的优势株均为HCV1b型，其次为2a型，郑州地区有1a型菌株的发现.
Keywords:hepatitis C-like viruses;genotype;polymor-phism，restriction fragment length
Abstract:AIM To investigate the genotypes of HCV in the HCV infected samples in Xi’an and Zhengzhou.METHODS Genotypes of HCV were determined by restriction fragment length polymorphism（RFLP）analysis of the5’untranslated regions（UTR）of different HCVs.Forty-six HCVRNA posi-tive samples from Xi’an and forty from Zhengzhou were stud┐ied.RESULTS Among the forty-six samples from Xi’an:25/46（54.3%）were found to be of1b genotype，17/46（37.0）were2a genotype and4/46（8.7%）were mixed-genotype with1b and2a.Among those from Zhengzhou:19/40（47.5%）were1b，13/40（32.5%）were2a，3/40（7.5%）were1a，4/40（10%）were mixed-genotype with1b and2a，1/40（2.5%）were mixed-genotype with1a and1b.CONCLUSION In both Xi’an and Zhengzhou，the pre-dominant isolates are genotype1b，followed by2a.Cases of genotype1a were found in Zhengzhou.
0 引言
近年发现丙型肝炎病毒（HCV）有6个基因型及50多个亚型［1］ .在不同地区不同人群中HCV基因型分布有一定差异［2］ .为了解西安和郑州地区丙型肝炎患者的HCV基因型分布，我们对两地共86份HCVRNA阳性标本进行RFLP基因分型研究.
1 材料和方法
1.1 材料 1997/1999年间收集西安市中心医院、唐都医院传染科以及郑州解放军153医院住院及门诊确诊的丙型肝炎患者血清，经5’非编码区（5’UTR）通用引物RT-PCR确认，西安46份和郑州40份肝炎患者血清HCVRNA阳性，取这种血清再分型.M-MLV购自GIBCO公司，Rasin，TaqDNA聚合酶购自华美，随机引物购自PROMEGA，脱氧核苷三磷酸（dNTPs），HCVPCR扩增引物由上海SANGON提供，DNA快速纯化回收试剂盒购自博大科技，BSH1236Ⅰ为MBI产品，HaeⅢ，HinfⅠ购自PROMEGA，ScrFⅠ购自SIGMA.
1.2 方法
1.2.1 RNA提取和cDNA合成 50μL血清内加入50μL消化液（4mol・L-1 异硫氰酸胍，25mol・L-1 柠檬酸三钠，pH7.0，0.1mol・L-1 2-巯基乙醇和5g・L-1 十二烷基肌氨酸钠）裂解，等体积水饱和酚，氯仿异戊醇抽提两次后，乙醇沉淀，沉淀物溶于11μL1g・L-1 DEPC水，于70℃水溶变性10min，加入4μL5×M-MLV buffer，1μL10mol・L-1 dNTP，2μL0.1mol・L-1 DTT，0.6μL随机引物，16U RNasin，200U M-MLV，总反应体积为20μL，37℃水浴1h，合成cDNA.
1.2.2 HCVcDNA的套式PCR扩增 两对引物H1/h3，H3/H4选自HCV5’NCR区基因，将反转录产物进行5’NCR套式PCR扩增后得到一条252bp的扩增片段.
1.2.3 限制性长度多态性分析（RFLP） 第2轮PCR产物纯化回收，溶于50μL TE（pH8.0），取其8μL加入1μL10×酶反应buffer，10U的如下内切酶:（a）HaeⅢ（b）HinfI（c）Bsh1236I或（d）ScrFI，37℃保温4h，消化产物40g・L-1 琼脂糖胶电泳，EB染色后，紫外灯下观察橙红色荧光带.
1.2.4 5’NCR区限制性酶切图谱的预测 见Fig1.
图1 5’NCR区限制性酶切图谱的预测 略
2 结果
2.1 限制性酶切产物电泳图谱 见Fig2.
图2 5’NCR区RT-PCR扩增产物限制性酶切电泳图谱 略 转贴于 2.2 RFLP基因分型结果
2.2.1 西安地区HCV基因型 46例HCVRNA阳性血清标本中，25例（54.3%）为1b型，17例（37.0%）为2a型，4例（8.7%）为1b/2a混合感染. 2.2.2 郑州地区HCV基因型 40例HCVRNA阳性血清标本中，1a型3例（7.5%），1b型19例（47.5%），2a型13例（32.5%），1b/2a混合感染4例（10.0%），1a/1b混合感染1例（2.5%）.
3 讨论
HCV基因组具有很高的变异性.根据HCV全基因序列或经PCR扩增后的基因序列片段的同源性，HCV可分为6型50多个亚型［1］ ，型间的变异程度可达33%［3］ .越来越多的资料表明，不同型HCV的病毒血症、病情严重程度和对干扰素治疗的反应均各不相同，说明HCV基因的变异可能与丙肝的慢性化及HCV相关的肝细胞癌的发生密切相关.目前对世界各地获得的HCV病毒株的基因型别分析表明，不同型HCV有一定的地区分布［4］ .如欧美国家HCV1-3型常见，其中1a型占绝大多数;远东包括中国、日本的大部分地区，1b，2a，2b型常见，1b型为主要的优势株;3型主要分布在印度、巴基斯坦、泰国和新加坡等国家;4a型主要分布在中东、埃及和中非地区;5a型以南非地区为主;6a型则仅在越南、马来西亚等东南亚国家及中国的香港、澳门发现.
我们报道了西安和郑州地区的HCV基因型分布，发现两地患者中HCV型分布基本相似，均以1b型为主，其次为2a型，并有一定的混合感染.同北京［5］ 、乌鲁木齐［6］ 、广州［7］ 、贵州［8］ 、泰安［9］ 等地报道结果相比，西安与郑州地区2a型所占比例偏高，分别为36.96%和32.50%.Wang等［10］ 调查了中国大陆7个城市，认为我国南方城市主要流行1b型，如南京、南宁、成都等地区90%以上为1b型，而北方城市以2a型为主，如哈密、沈阳、兰州等地2a型占46%～70%.我们的研究结果同此相符，因西安和郑州介于Wang等［10］ 调查的南北方城市之间.这对两地丙肝患者的治疗、预后判断及疫苗研制有一定指导意义，并使国内HCV基因型分布资料进一步完善.本研究的不足之处在于:样本例数较小，研究对象以慢性肝病患者为主，不象无症状HCV阳性献血员更能反映HCV基因型在人群中的分布，因此，有必要扩大样本量，选择人群资料进一步研究.值得注意的是，我们本次研究还发现了郑州地区有1a型的存在，这在国内报道中很少见，说明除1b和2a型外，尚有一定比例其他型别的存在，有待于进一步验证.
参考文献
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