作者：张文红 刘新平 王吉村 韩月恒 邓艳春 周洁 药立波
【关键词】 免疫血清
关键词: NDR2;基因，Myc表达;免疫血清;亲和纯化;易感性与特异性
摘 要:目的 制备高效价的NDR2抗体. 方法 构建pRset-A-ndr2，pGEX-4T-1-ndr2-a和pGEX-4T-1-ndr2-b三种重组表达质粒，并分别在大肠杆菌中诱导表达相应的融合蛋白;用全长GST-NDR2蛋白免疫兔，然后用GST-NDR2-A和GST-NDR2-B片段加强免疫;对包涵体形式表达的6His-NDR2进行初步的纯化;利用固定于硝酸纤维素膜上的NDR2抗原亲和吸附纯化抗血清. 结果 经免疫得到了高效价的兔抗人NDR2多克隆抗血清，亲和纯化提高了NDR2抗体的特异性;免疫组化表明NDR2是一种胞浆蛋白. 结论 用全长NDR2蛋白免疫兔，再用片段加强免疫，可以提高蛋白的抗原性，制备得到高效价的抗体.纯化后的特异性NDR2抗体，为进一步研究NDR2的功能打下了必要的基础.
Keywords:n-myc downsream regulator2;genes，myc;gene sensitivity and expression;immune sera;affinity purification;specificity
Abstract:AIM To obtain an anti-NDR2polyclonal anti-body.METHODS Full length of ndr2cDNA was cloned in-to pRset-A vector and two truncated sequences of ndr2were cloned into pGEX-4T-1vector respectively.The fusion pro-teins were expressed in E.coli and partially purified by inclu-sion body fraction.Immunization in rabbits with the whole NDR2protein was reinforced with two truncated fragments of NDR2twice.The anti-NDR2specific antibody was puri-fied by absorbing antiserum with NDR2antigen immobilized NC filter.RESULTS High titer of antiserum against NDR2was obtained in immunized rabbits and the specificity to NDR2was increased after affinity purification.Immunohis-tochemical test with this antibody showed that NDR2is a cy-toplasmic protein.CONCLUSION Reinforcement with trun-cated NDR2proteins can strengthen the antigenicity of NDR2protein in rabbits.The specific NDR2antibody can be ob-tained by NC filter affinity purification.
0 引言
Ndr（N-myc downstream regulated gene）家族是研究N-myc下游调节基因时从小鼠胚胎中发现的一组新基因.目前已报道的成员有4个:ndr1，ndr2，ndr3和ndr4，它们具有较高的同源性，但表达水平在组织发育阶段和分布上差异明显，具体功能还不清楚.人的ndr2是本室于1999年从正常成人全脑cD-NA文库中最先发现并克隆得到.其染色体定位于14q11.2，含有16个外显子，15个内含子;mRNA全长为2024nt，编码含有357个氨基酸残基，M
r 约40000的蛋白质.
深入研究NDR2在体内的组织细胞和亚细胞水平分布特点及其功能，需要高效价和高特异性的NDR2抗体.为此，我们在大肠杆菌中分别融合表达了全长NDR2蛋白和两个分别含289个氨基酸和198个氨基酸的3’末端的NDR2蛋白片段，并对全长的6His-NDR2做了初步纯化.在用全长NDR2蛋白免疫兔后，我们尝试用两个片段NDR2蛋白加强免疫，期望能提高其抗原性;为进一步提高NDR2抗血清的特异性，我们还试着对抗血清做了亲和吸附纯化.高效价和高特异性的NDR2抗体的制备，将为NDR2功能的深入研究提供有力工具和重要线索.
1 材料和方法
1.1 材料 重组质粒pGEX-4T-1-ndr2由本室构建，JM109，JM109DE3菌种和pGEX-4T-1，pRset-A载体为本室保存;DOC（脱氧胆酸钠）、SKL（十二烷基肌氨酸钠）等购于华美生物技术公司;DNA marker DL2000，PMD18-T载体购于宝生物工程有限公司;ABTS、胶回收和质粒提取试剂盒为华舜生物技术公司产品;PCR引物为赛百盛生物工程公司合成;成年新西兰兔（体质量1.2kg）由第四军医大学动物实验中心提供;HRP标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz Biotechnology;Western发光底物为Pierce产品.SABC免疫组化试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品.
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增和克隆 模板为pGEX-4T-1-ndr2，截短的NDR2编码区大片段（ndr2-a）的5’端引物为:5’&>cgggatccatgcaggaaatcattcagaac&<3’;小片段（ndr2-b）5’端引物为:5’&>cgggatccatg-gattgggcagcccacaagc&<3’.3’端引物公用，为:5’&>cggaattcaacaagggccattcaacaggagac&<3’.PCR反应参数为:94℃5s;68℃4min，35个循环.PCR产物经琼脂糖电泳，胶回收，克隆入PMD18-T载体.重组质粒（分别命名为PMD18-T-ndr2-a和PMD18-T-ndr2-b）用EcoRI和BamHI酶切鉴定，含预期大小插入片段的重组质粒测序进一步验证.
1.2.2 表达载体的构建 用EcoRI和BamHI从pGEX-4T-1-ndr2重组质粒上切下ndr2，并插入pRset-A载体;用同样两个酶从测序验证过的重组质粒PMD18-T-ndr2-a和PMD18-T-ndr2-b上切下两个插入片段，克隆入pGEX-4T-1载体.重组表达质粒用EcoRI和BamHI酶切鉴定，并对pRset-A-ndr2测序验证.
1.2.3 融合蛋白的表达和初步纯化 pGEX-4T-1-ndr2，pGEX-4T-1-ndr2-a和pGEX-4T-1-ndr2-b分别转化E.coli JM109，pRset-A-ndr2转化E.coli JM109DE3 .用200mL LB（含amp）培养四种阳性重组单菌落，0.1mmol L-1 IPTG诱导4h.120g L-1 SDS-PAGE分析表达结果.取0.3g表达6His-NDR2融合蛋白的菌体，悬于3mL缓冲液A（50mmol L-1 Tris-HCl，PH7.9;0.5mmol L-1 ED-TA;50mmol L-1 NaCl;50g L-1 甘油;0.5mmol L-1 DTT）中，冰浴超声裂菌30s×5次;4℃，12000 g离心10min;沉淀中加入3mL缓冲液A和350μL200g L-1 DOC，重悬，室温静置10min，4℃，12000g离心10min，重复一次;包涵体沉淀加入3mL缓冲液A和50μL200g L-1 SKL，剧烈搅动使沉淀慢慢溶解，静置50min，4℃，12000g离心10min，弃沉淀.变性蛋白对缓冲液A于4℃透析24h，期间更换3次新鲜缓冲液，并充分搅拌.
1.2.4 兔抗人NDR2抗血清的制备 SDS-PAGE分离NDR2融合蛋白，从胶上切下目的蛋白条带，研碎，溶于生理盐水.用全长GST-NDR2蛋白初次免疫5只新西兰兔（背部皮下多点注射，后同），1mo后用GST-NDR2-A和GST-NDR2-B混合加强免疫，以后每两周加强1次，于第4次加强免疫后8d取兔血清.
1.2.5 多克隆抗血清效价的检测 初步纯化的6His-NDR2蛋白以2×10-6 g L-1 的浓度包被ELISA板，间接ELISA法检测NDR2多克隆抗血清的效价，见文献［6］.
1.2.6 抗体的纯化和验证 将初步纯化的6His-NDR2融合蛋白约1mg进行SDS-PAGE分离，再转移于硝酸纤维素滤膜（NC膜）上，剪下抗原条带，用10mL50g L-1 的脱脂奶粉封闭1h，加入100μL抗血清，4℃平缓摇动过夜;于室温用0.15mol L-1 NaCl漂洗硝酸纤维素滤膜20min，再用PBST漂洗两次，20min 次-1 ;弃洗液，在滤膜上加2mL洗脱缓冲液（0.2mol L-1 甘氨酸，ph3.8;1mmol L-1 EG-TA），轻摇15min，加入约110μL1mol L-1 Tris碱中和至pH接近中性.用增强化学发光蛋白免疫印迹法验证所纯化抗体的特异性，见文献［6］.
1.2.7 免疫组织化学染色 对人甲状腺组织行常规石蜡切片，用SABC免疫组化试剂盒进行染色.一抗稀释度为1 1500;二抗为羊抗兔IgG，1 3000稀释.未免疫兔血清代替一抗作为阴性对照.DAB显色，常规脱水，透明，中性树脂封片.
2 结果
2.1 3种表达载体的构建 从pGEX-4T-1-ndr2中扩增出了两个截短的NDR2编码区ndr2-a和ndr2-b（大小分别为867bp和594bp），并插入到PMD18-T载体中（Fig1），测序验证正确;成功将ndr2克隆入pRset-A载体，测序验证正确;从PMD18-T-ndr2-a和PMD18-T-ndr2-b上将ndr2-a和ndr2-b切下并克隆入pGEX-4T-1中（Fig2）.
2.2 GST融合蛋白的表达 加上Mr 26000的GST部分，全长GST-NDR2的Mr 约65000，两个截短的NDR2与GST的融合蛋白Mr 分别约为58000，48000.经IPTG诱导，成功得到了融合表达的GST-NDR2，GST-NDR2-A和GST-NDR2-B，其大小与预期相符（Fig3）.
图1 － 图3 略
2.4 NDR2多克隆抗血清的效价 免疫的5只兔所得抗血清效价均大于1 6400，其中两个已达到1 12000.而本室以前用仅全长NDR2免疫所得抗血清效价只有1 200，这表明用全长NDR2抗原初次免疫兔后，再用片段NDR2抗原加强免疫，可以提高NDR2蛋白的抗原性，从而得到高效价的多克隆抗血清.
2.5 Western blotting检测NDR2抗体纯化结果 免疫得到的多克隆抗血清虽然效价很高，但有不可避免的非特异性.经过固定于硝酸纤维素膜上的NDR2抗原亲和吸附抗血清，得到了高特异性的NDR2抗体（Fig5）.
2.6 免疫组化染色结果 在甲状腺组织滤泡细胞胞质内可见棕黄色阳性免疫反应颗粒（Fig6），而阴性对照不着色.说明NDR2蛋白定位于细胞质中，是一种胞质蛋白.
本室前期研究表明:ndr2基因在人中枢神经系统的大脑皮质、白质和神经核中呈广泛高表达，在与神经细胞同样属于终末分化细胞的唾液腺细胞和骨骼肌细胞中也呈高表达;而在具有分裂能力的骨髓干细胞和精细胞中表达量很低;在分裂增殖能力旺盛的10种肿瘤细胞（包括白血病、淋巴瘤、肺癌、结肠癌胶质瘤和腮腺癌）无表达，在胚胎的脑、心、肝、肾、肺等脏器的表达量明显低于成人相应器官.其表达量与器官的成熟程度呈正相关，而与细胞的增殖能力呈负相关.即成熟程度高、增殖能力低的细胞表达量高，成熟程度低、增殖能力强的细胞表达量低.这提示其很可能参与肿瘤的发生与发展.人的ndr2基因与小鼠的ndr2基因有93%的同源性，在小鼠该基因也称为脑发育相关基因，推测其在脑组织内广泛高表达还可能与神经系统的发育有关.
图5 抗血清纯化前后的特异性分析 略
为研究NDR2的功能，本室曾用全长GST-NDR2进行抗血清的制备，但所得的抗血清效价仅有1 200左右，难以满足研究的需要.为了得到高效价的NDR2多克隆抗血清，在用全长NDR2抗原初次免疫兔后，我们尝试用两个截短的NDR2加强免疫，以提高NDR2蛋白的抗原性.在检测抗体效价时，我们改用6His融合的全长NDR2抗原包被ELISA板，以避免针对GST部分的抗体对多抗效价检测的影响.结果表明该方法对制备NDR2多克隆抗体行之有效，可以提高抗体效价10倍左右.此外，实验表明6His-NDR2在大肠杆菌中的表达形式为包涵体，经过超声处理、脱氧胆酸钠洗涤，再用十二烷基肌氨酸钠变性 和复性，纯度可以大于80%.是一种方便的NDR2蛋白的制备方法.
图6 NDR2蛋白免疫组化结果 略
为进一步得到高特异性的NDR2抗体，将复性的6His-NDR2蛋白经SDS-PAGE分离，再转移于NC膜上，剪下抗原条带，依据亲和原理吸附从抗血清中纯化NDR2抗体.经western blotting检测，我们得到了单特异性的NDR2抗体.纯度和产量足以做NDR2的组织分布和功能等研究.我们实验室用该抗体做了几种组织的免疫组化染色，结果发现NDR2分布于细胞质中，是一种胞质蛋白，为进一步研究NDR2的功能奠定了基础.
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