关于同种异体组织工程复合皮肤移植修复大鼠皮肤缺损

　　　　　　作者：刘晓亮　金岩　聂鑫　刘源　吕红兵　赵宇　王军琳　Tipoe GL

【关键词】 免疫排斥
　　关键词: 皮肤;培养;移植;免疫排斥
　　摘 要:目的 检测组织工程皮肤的生物活性及免疫原性，探讨临床可行性. 方法 以新生SD大鼠皮肤为原材料培养组织工程复合皮肤并将其移植到成年Wistar大鼠，通过大体观察、组织学检测对不同时间自体、异体及组织工程复合皮肤移植进行比较，研究了组织工程复合皮肤的存活及免疫排斥情况. 结果 异体皮肤移植组有明显的免疫排斥，组织工程皮肤组未见有明显排斥，且与自体皮肤结合良好. 结论 组织工程复合皮无明显的免疫排斥，是较好的皮肤移植替代品，具有潜在的发展前景.
　　
　　Keywords:skin;culture;graft;immunorejection
　　
　　Abstract:AIM To observe the immunogenicity and bioac-tivity of tissue engineering skin and to determine its possibili-ty on clinic.METHODS The tissue engineering skin which drew the materials from neonatal SD rats was cultured，and then grafted to adult Wistar rats to be compared with rats au-tograft and allograft through observing their developments and histological determinations.RESULTS The allograft skin showed significant rejection，but the tissue engineering　skin had no obvious rejection and was bound well with hosts’skin.CONCLUSION Tissue engineering skin is a better skin substitute and exhibits no distinct rejection.
　　
　　0 引言
　　
　　近年来组织工程皮肤已取得可喜的进步并初步应用于临床，所应用的组织工程皮肤移植后并不引发临床可见的排斥反应，机械性能也较以往人工皮肤大为提高.我们通过不懈努力成功培养出组织工程复合皮，我们目的在于通过动物实验观察并比较组织工程复合皮的存活及免疫排斥情况.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 新生SD大鼠若干，清洁级雄性SD大鼠15只（第四军医大学实验动物中心提供），体质量（200±20）g，清洁级雄性Wistar大鼠30只（北京大学医学院动物中心提供），体质量（200±20）g.胰蛋白酶（Trypsin）、FAD培养液、DMEM培养液均购自Gibco公司，I型胶原购自Sigma公司，PBS溶液（0.01mmol・L-1 ）.
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 表皮角朊细胞的分离培养 无菌条件下取SD新生仔鼠背部皮肤，去除皮下组织，用含抗生素的PBS冲洗，将标本切成规则的细条状，置于2.5g・L-1 胰酶中4℃过夜，仔细将表皮与真皮分离，分别放置不同的平皿中.将表皮放入含培养液的离心管中反复吹打，收集分离的细胞悬液，台盼蓝染色法行活细胞计数，用FAD培养液以1×105 ～1×106 ・cm-2 的密度接种.待细胞长满后，用trypsin（2.5g・L-1 ）∶EDTA（1g・L-1 ）=1∶1消化传代.
　　
　　1.2.2 真皮成纤维细胞的培养 将前述分离的真皮放入含新鲜培养液的离心管中，反复吹打，收集分离的细胞悬液，台盼蓝染色法行活细胞计数，用DMEM培养液以密度1×105 ～1×106 ・cm-2 的接种.细胞长满后，用trypsin（2.5g・L-1 ）消化传代.
　　
　　1.2.3 组织工程皮肤的构建 将密度为1.5×109 ・L-1 的真皮成纤维细胞液与自小牛皮提取的Ⅰ型胶原混合，37℃孵育凝固后，加入培养液培养过夜;次日又在其表面接种密度为1×108 ・L-1 的角朊细胞，继续培养至细胞汇集成片，将复合了细胞的胶原升至气液面进行器官培养，培养1～2wk即获得组织工程皮肤，冻存备用.
　　
　　1.2.4 动物模型的建立 20g・L-1 戊巴比妥钠（30～50mg・kg-1 ，ip）麻醉大鼠，后在其背部切取全层皮作圆形创面，直径3cm，以供皮肤移植.实验共分为3组:自体移植组:SD大鼠15只，做自体皮片回植，取全层皮片，仔细去除皮下组织并回植于创面，7-0缝合，加压包扎，作为阴性对照，以排除手术操作技术和术后皮片感染、移动等人为因素致皮片坏死的可能性;异体移植组:以SD大鼠为供皮鼠，Wistar大鼠作为受皮鼠（n=15），手术同前;组织工程皮肤组:Wistar大鼠作为受皮鼠（n=15），手术同前.各组均术后7d拆除加压缝合包，10d拆线，逐日观察皮片情况，当植皮后皮片开始肿胀、发紫、周围呈现炎性反应时，即诊断皮片开始排斥，若皮片有2/3以上坏死即诊断为完全排斥，从手术植皮之日到排斥之日即定为成活时限.术后7，10，14，20和30d取标本作HE染色，VG染色，观察组织学变化，最长观察60d.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 大体观察 自体移植组:术后7d拆包时皮面光滑，有光泽，无浮动现象，打包固定期间，皮片无收缩，10d时皮片已愈合牢固，柔韧性好，拆线后，皮片开始收缩，并开始长出毛发，30d时收缩率已达30%～40%，无色素沉着.异体移植组:10d以前皮片成活过程同自体移植组，平均11d以后开始出现排斥反应，皮片局部变色、变硬，边缘翘起，至14d时全部皮片均被完全排斥，表皮呈干性坏死，黑痂状，痂皮脱落后创面暴露，30d时，剩余真皮也逐渐坏死，形成肉芽组织创面.组织工程皮肤组:拆包时皮面光滑，色泽红润，无浮动现象，打包固定期间皮片无收缩，拆包后皮片开始收缩，10d时收缩率已达50%，30d时达70%，以后基本稳定，皮片愈合良好，至60d时仍未有排斥反应发生，且无色素沉着.

　　2.2 组织学检测 拆包后，各组于术后7，10，14，20和30d取标本观察组织学变化，行HE染色，光镜下可见，自体移植组:术后7d即可见皮片成活，细胞结构清晰，组织结构完整，表皮较薄，真皮层内胶原纤维排列紧密，炎性细胞少见，以后可见表皮层逐渐增厚，钉突明显.异体移植组:术后7d同自体移植组，术后10d即可在表皮层下见到炎细胞浸润，术后14d， 全部表皮和部分真皮坏死，表皮下，真皮层内有大量炎细胞浸润，术后30d真皮层也基本坏死，创面为肉芽组织覆盖.组织工程皮肤组:术后7d，表皮层有角化，细胞结构清晰，核浆比高，细胞层次不明，基底细胞层不明显，排列紊乱，表皮真皮连接界面平坦，无钉突，真皮层内有大量排列齐整的成纤维细胞，胶原纤维排列疏松，无方向性，可见到少量毛细血管，有少量散在的炎性细胞;术后14d表皮层有增厚，层次较前较为明显，基底细胞层细胞形态不规则，连接不紧密，真皮层内胶原纤维量较前有增多，局部表皮层下可见有束状的胶原纤维，有较多毛细血管生成，仍有散在的炎细胞;术后30d皮片与自体皮肤结合良好，表皮层结构完整，层次清晰，少钉突，有角化，细胞分四层，基底细胞呈柱状，单层排列，结合紧密，真皮层成纤维细胞排列整齐，胶原纤维量多，横向排列有序，无板块状形成，炎细胞罕见，有大量的毛细血管生成.
　　
　　2.3 VG染色 术后7d光镜下可见组织工程皮肤真皮中胶原纤维染色很浅，与自体皮肤对比非常明显，界限清晰，未见到有束状的胶原纤维;术后14d光镜下可见染色明显加深，与自体皮肤对比反差仍很明显，局部可见到有细小的胶原纤维束;术后30d光镜下见染色较深，与自体皮肤相近，真皮中有大量横向排列的胶原纤维，束细小，分布较广.
　　
　　3 讨论
　　
　　人表皮细胞培养并移植进行了深入的研究［1-3］ ，人工皮肤近年来虽然应用较为广泛，但主要是单层上皮结构或无细胞的基质.理想的皮肤替代物应能容易得到，不增加患者的疼痛和疤痕，组织结构较完整，不排斥，永久覆盖创面，弹性好，稳定性好，有选择渗透性，挛缩轻［4］ ，应具有表皮和真皮两层结构，两者之间连结紧密，皮棘丰富.现在需要的是既能克服单纯自体表皮片移植后外观及功能差等缺点，又能使异体真皮移植后不产生或少产生排斥，能够为患者大量提供的有效的皮肤代用品.
　　
　　我们所采用的组织工程的皮肤替代物可以在1～2wk内获得，手术中便于操作，移植到创面后很快即与创面良好贴附，其中表皮和真皮成分能尽快完成自身增殖、分化和功能成熟，形成更接近于生理的皮肤替代物，而且排斥反应小.新生大鼠本身抗原性很弱，而我们用胰酶消化法，又可去除携带MHCⅡ类抗原的皮肤附件，因此在最大程度上降低了组织工程皮肤的抗原性，业已证实成纤维细胞（Fb）不含有MHCⅡ类抗原［5］ ，并不激发免疫排斥反应，不能刺激静止性T淋巴细胞产生IL-2，所以一般不导致排斥反应.本研究中采用的Wistar大鼠和SD大鼠为封闭群动物，它们之间MHC不同，两者间进行组织移植，会产生强烈的免疫排斥反应，而我们的组织工程皮肤来源同为SD大鼠，移植于成年Wistar大鼠仅引起轻微的炎症反应，并不足以引起免疫排斥.以往研究中发现由于组织工程皮肤没有血管系统供给营养，表面的上皮容易坏死脱落［6］ .我们所培养的组织工程皮在这方面有可喜的进步，术后7d即可发现真皮中有毛细血管长入，30d时可见有丰富的毛细血管.但是如果同类其他产品一样，本实验所研究的组织工程皮肤也还不具备色素细胞和毛囊等皮肤附件组织，还有待进一步研究，向临床应用方向发展.
　　

参考文献

　　
　　［1］Hu DH，Chen B，Chen J，Tang CW，Liu Y，Wang JB，Xu MD.Expression and secretion of hEGF by human keratinocytes after
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　　［2］Han JT，Chen B，Liu SJ，Tang CW，Su YJ.Biological charac-teristics of human skin fibroblasts in differentculture conditions ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（10）:1185-1188.
　　［3］Jiang DY，Chen B，Su YY，Hu DH，Jia CY.Preparation and experimental study of allogeneic acellular dermal matrix for composite skin grafting ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:375-378.
　　［4］Phillips TJ.New skin for old ［J］.Arch Dermatol，1998;134（3）:344-349.
　　［5］Lamme EN，Leewwen RT，Jonker A，van Marle J，Middelkoop E.Living skin substitutes:Survival and function of fibroblasts seeded in a dermal substitute in experimental wounds ［J］.J In-vest Dermatol，1998;111（6）:989-995.
　　［6］Black AF，Berthod F，L’heureux N，Germain L，Auger FA.In vitro reconstruction of a human capillary like net-work in tissue engineering skin equivalent ［J］.FASEB J，1998;12（13）:1331-1340.