关键词: 癌，肝细胞;β-连环蛋白;免疫组织化学
摘 要:目的 研究β-连环蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及其与原发性肝细胞癌分化、侵袭转移和预后的关系. 方法 应用免疫组织化学方法对63例原发性肝细胞癌石蜡包埋标本进行β-连环蛋白半定量检测. 结果 有49例（78%）原发性肝细胞癌β-连环蛋白阳性表达，低分化癌的β-连环蛋白阳性率明显高于高分化癌（P&<0.05）.β-连环蛋白阳性表达率在AFP高表达肝癌组高于AFP低表达组（P&<0.05）.β-连环蛋白阳性表达率在有淋巴结转移肝癌组织高于无淋巴结转移组（P&<0.05）.β-连环蛋白阳性表达患者2a生存率（11%）显著低于阴性表达者（32%，P&<0.05）. 结论 β-连环蛋白表达与肝癌组织的分化程度、有无淋巴结转移、患者的AFP水平呈正相关，β-连环蛋白表达与患者预后相关，可以作为判断原发性肝细胞癌预后的生物学指标.
Keywords:carcinoma，hepatocellular;β-Catenin;immuno-histochemistry
Abstract:AIM To investigate theβ-Catenin expression in primary hepatocellular carcinoma and its relation ship with tumor differentiation，AFP level，invasion，metastasis and prognosis.METHODS β-Catenin expression was detected in63cases of primary hepatocellular carcinoma by using im-munohistochemical technique（DAB method）.RESULTS Expression ofβ-Catenin in77.89%cases of primary hepato-cellular carcinoma and15%cases of liver cirrhosis was stronger than that in the surrounding normal liver tissue.The positivity rate ofβ-Catenin was higher in poorly differen-tiated carcinoma group than that in well differentiated group（P&<0.001）.The positivity rate ofβ-Catenin was higher in high level AFP group than that in low level AFP group（P&<0.001）.The positivity rate ofβ-Catenin was higher in metastatic carcinoma group than that in nonmetastaatic group（P&<0.001）.The two-year survival rate was lower inβ-Catenin positive group（32.5%）than that in negative group（11.3%，P&<0.05）.CONCLUSION Strong or positive ex-pression ofβ-Catenin is related with differentiation，AFP lev-el and metastasis of primary hepatocellular carcinoma.The expression ofβ-Catenin might have prognostic value.
0 引言
原发性肝细胞肝癌（HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制和发病原因至今未明.已有报道，一些细胞因子在正常细胞中异常表达，或正常细胞内不应出现的某些因子反而出现聚集状态，将启动不同的信号转导途径，直接或间接地影响核内某些基因的表达，导致细胞增殖过度，引发肿瘤［1，2］ .
β-连环蛋白（β-Catenin）作为细胞内的一种蛋白质，既是Wnt信号传导途径中关键调控因子，又与细胞间粘附作用有关，而这两种作用与肿瘤发生、发展均有密切关系［3］ .已有报道称在大肠癌、肺癌、肾癌等肿瘤的研究中发现癌细胞胞质内β-Catenin表达增加［4-6］ ，但其在肝癌中的表达及其临床意义的报道在国内还很少.我们应用免疫组织化学方法检测63例原发性肝细胞癌石蜡包埋标本中β-连环蛋白的表达，并探讨其临床意义，为防治提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 1988/2001第四军医大学西京医院普外科手术切除的原发性肝细胞癌病例标本63（男46，女17）例，年龄36～72（平均55）岁.按1991年WHO病理分类标准，肝细胞肝癌63例，其中Ⅰ级14例，Ⅱ级16例，Ⅲ级33例，其中手术时发现肝外淋巴结转移16例.另取肝硬化20例，正常肝组织10例.
1.2 试剂 兔抗人β-catenin多克隆抗体（附阳性对照片）、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均为武汉博士德生物制品公司产品.
1.3 方法 标本均经40g・L-1 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片，分别进行HE染色及免疫组化染色，切片常规脱蜡至水，h3 O
2 灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，正常山羊血清封闭，分别滴加β-catenin一抗，4°C过夜，滴加生物素化二抗，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片，将β-catenin染色阳性的肝癌组织作为阳性对照，空白对照选择PBS代替一抗.
1.4 β┐Catenin染色结果判定标准 按肿瘤细胞着色强度及阳性细胞分布范围分为3个等级:全片未见着色或极少量细胞散在着色为（-），胞质和胞膜棕黄色着色为阳性，10%～30%细胞着色但镜下易观察到为（+），大于30%细胞清晰着色为（）.
统计学方法:免疫反应结果及其临床病理参数的关系采用χ2 检验，生存率计采用寿命表法，不同分组间生存率差异使用时序检验.
2 结果
2.1 β┐Catenin在HCC中表达的临床病理学特点 β-Catenin以膜定位为主，在10例正常肝组织中无1例阳性表达;20例肝硬化组织中仅3例（15%）呈（+），且主要定位于肝细胞膜的接触面和胆小管面，未见肝细胞的血窦面和胞质着色;而63例HCC中有49例（78%）标本β-Catenin呈阳性表达，且36例为（）表达，主要定位于肝癌细胞的外周胞质、血窦面、接触面和腺腔面.胞质β-Catenin阳性着色为点状着色或片状浅着色，胞膜β-Catenin阳性着色为不规则线状或颗粒状着色.在靠近毛细胞胆管腔面和小胆管腔面常见肝癌细胞阳性深着色.β-Catenin的分布呈异质性:有大片细胞广泛表达，小片细胞区域表达，散在表达或大片细胞中仅数个细胞表达（Fig1，2）.肝癌组织和非肝癌组织的β-Catenin表达亦呈异质性:肝癌组织β-Catenin表达为外周胞质点状或片状浅着色，粗大的胞膜不规则线状、点状着色，偶见胞核深染;而非肝癌组织大都阴性表达，或少量的胞膜线状、点状着色.β-Catenin的表达与肿瘤的分化程度呈反比，即分化差时β-Catenin的表达趋于增多.Ⅰ级中（-）8例、（+）表达1例、（）表达5例;Ⅱ级中（-）2例、（+）表达5例、（）表达9例;Ⅲ级中（-）4例、（+）表达7例、（）表达22例.3组比较，差异有显著性（P&<0.05）.此外，β-Catenin的表达与 HCC有无淋巴结转移呈正相关性，在淋巴结转移组β-Catenin（-）、（+）、（）表达的例数分别为1，7，8;在无转移组分别为13，6，28例;两组比较，差异有显著性（P&<0.05）.瘤体大小不影响β-Catenin的定位、分布和表达. 图1 － 图2 略
2.2 β┐Catenin与患者AFP水平及预后的关系 β-Catenin的阳性表达与HCC患者AFP水平呈正比，即AFP水平越高者β-Catenin阳性表达越强，AFP&<400μg・L-1 组β-Catenin（-）、（+）、（）表达例数分别为11，5，13;AFP&>400μg・L-1 组分别为3，8，23例.二组之间存在显著性差异（P&<0.001）.63例HCC患者中有45人获得术后随访，随访率为71%，患者生存时间为3mo～6a，除去由于术后并发症生存少于6mo的病例，β-Catenin阳性表达组平均生存期7mo，而无表达组17mo，Logrank检验显示两者的生存率差异有显著性（P&<0.05）.
3 讨论
HCC的发生、发展是一个多基因参与、多因素影响、牵涉多条信号传导途径的复杂过程.Wnt信号转导途径异常是目前研究肿瘤发生机制的一个热点.而β-Catenin正是这一传导通路的关键调控点［7］ .本实验结果显示，49/63的HCC标本中β-Catenin呈阳性表达，且表达程度与HCC的病理分级、术后存活时间呈负相关，与患者AFP水平，有无淋巴结转移呈正相关.表明β-Catenin在HCC发生、发展过程中的作用不容忽视.β-Catenin被发现是一种与跨膜粘附分子钙粘着素（Cadherin）相连的胞内特异蛋白，以复合体形式存在于各类上皮和某些实质细胞中，介导细胞间连接，近几年研究发现，β-Catenin作为一种关键Wnt蛋白，与APC，GSK-3β复合、解离、胞质积累、入核，作用于核内转录因子TCF/LEF家族，促进基因转录［8-11］ ，或刺激增殖，或抑制凋亡，从而认为β-Catenin是一种癌基因［12］ .其致癌机制可能是发生在氨基端的突变使变异的β-Catenin大量积累而激活了转录因子.Yi等［13］ 报道β-Catenin/APC介导的Wnt途径的突变占肝癌发生的30%.关于癌细胞胞质内β-Catenin表达增加的原因，目前的看法主要是其降解减缓，而非生成增加.影响β-Catenin降解的因素有Wnt信号的增强，APC的突变以及β-Catenin本身的突变等.在Rubinfeld等［14］ 对黑色素瘤细胞系的研究中，发现β-Ccatenin的增加主要与其本身的突变有关，β-Catenin突变后可增加其稳定性，使其不被降解.Wnt信号的增强可以抑制APC对β-Catenin的降解作用.此外，也有报道发现，3个大肠癌细胞系中均有β-Catenin表达的增强，认为大肠癌癌细胞的增殖与转化与β-Catenin靶基因的持续转录关系密切，β-Catenin的靶基因可能就是大肠癌的癌基因
［15］ .
本研究结果显示，β-Catenin在肿瘤较靠近血窦、毛细胆管处表达较强，同时与肿瘤病理分级负相关，提示可以将β-Catenin作为分化差、易浸润转移的标志物;β-Catenin表达与AFP表达相关，可以协同原发性肝癌的临床诊断;手术标本中β-Catenin的表达情况可以作为判断患者预后的一个指标.
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