【关键词】 克隆
关键词: Toll样受体;亮氨酸;重复序列，核酸;逆转录聚合酶链反应;克隆，分子;序列分析
摘 要:目的 为研究TLR2胞外域在肽聚糖诱导的信号转导中的功能，构建TLR2胞外域及其氨基端和羧基端片段真核表达载体. 方法 提取HL-60细胞总RNA，以RT-PCR方法获取了TLR2胞外域cDNA片段，将其与pGEM-T Easy载体连接，转化E.coli JM109，建立了TLR2胞外域的cDNA克隆;籍此，又相继克隆了胞外域的氨基端和羧基端片段，然后将这三个片段克隆到真核表达载体pcDNA3中. 结果 序列分析表明，与GenBank中的人TLR2全长cDNA序列比较，仅4个碱基不同，同源性为0.998. 结论 成功获得了HL-60细胞TLR2胞外域及其氨基端和羧基端片段的克隆.
Keywords:Toll-like receptor;leucine;repetitive sequences，nucleic acid;reverse transcriptase polymerase chain reaction;cloning，molecular;sequence analysis
Abstract:AIM To find out the role of the extracellular do-main of TLR2in the peptidoglycan-induced signaling path-way，mammalian expression plasmids of the extracellular do-main of TLR2and its two fragments were constructed.METHODS The cDNA fragment encoding complete extra-cellular domain was isolated by semi-nested RT-PCR method with the total RNA extracted from HL-60cells，linked into pGEM-T Easy vector，transformed into E.coli JM109，and inserted into pcDNA3vector.Then two fragments amplified from it were linked into pGEM-T Easy vector and pcDNA3.RESULTS The result of sequencing indicated that the se-quences of our cDNA was identical to the corresponding parts of the mRNA for human TLR2in GenBank except4nu-cleotides，and with a homology of0.998.CONCLUSION The extracellular domain of TLR2and its two fragments are cloned successfully.
0 引言
果蝇（Drosophila）Toll和Toll样受体（Toll-like Receptors，TLRs）是一类跨膜蛋白，由胞外富含亮氨酸的重复序列（Leucine-rich repeats，LRRs）、跨膜区和胞内负责信号转导的结构域构成.TLRs属模式识别受体（Pattern Recognition Receptors，PRRs），可选择性识别具有病原体相关分子模式（Pathogen Association Molecular Patterns，PAMPs）特殊结构的病原体成分，如脂多糖（LPS）、肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）等，经胞内信号转导途径，激活系列免疫应答基因［1-3］ .TLR2胞外域与革兰阳性菌（G+ ）PGN成分的识别关系较肯定，但具体识别机制尚不清楚［4，5］ .为深入研究TLR2的结构与功能，及其与其他TLRs和辅助蛋白相互作用的分子机制，揭示其与感染性疾病的关系，探索新的防治与诊断手段，我们克隆了HL-60细胞系的TLR2胞外域及其氨基端（N端）片段和羧基端（C端）片段，并进行了序列分析、二级结构及理化特性预测.
1 材料和方法
1.1 材料 HL-60细胞系由第四军医大学细胞与分子免疫学教研室金伯泉教授提供;RPMI-1640购自美国HyClone公司;新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所;TRIzol○R 总RNA提取试剂盒购自GibcoBRL LIFE TECHNOLOGY公司;TaKaRa RNA LA PCR Kit（AMV）逆转录PCR试剂盒购自Takara Biotech有限公司;E.coli JM109菌株、pcDNA3质粒为本室保存;限制性内切酶BamHⅠ，XhoⅠ，EcoRⅠ和Lambda DNA/HindⅢ+EcoRⅠMarker购自华美生物工程公司;GeneRulerTM 50bp DNA ladder购自Fermentas公司;QIAEX○R ⅡGel Extraction Kit购自QIAGEN公司;Wizard
○R Plus MiniPreps DNA Purification Sys-tem及pGEM-T Easy载体购自美国Promega公司.
1.2 引物设计与合成 以GenBank中人TLR2mRNA序列（ACCESSION U88878，简称U88878序列）［4］ 为模板，设计6条引物.其中P1，P2，P3用于半巢式PCR扩增TLR2胞外域完整编码序列，P1和p4用于扩增其胞外域N端片段，而P5和P6用于扩增其胞外域C端片段（Fig1，Tab1）.引物全部由上海Sangon公司合成.
图1 略
表1 TLR2胞外域及其N端和C端片段PCR引物的设计 略
1.3 细胞培养 HL-60细胞在37℃，50mL・L-1 CO2 条件下，培养于含100mL・L-1 小牛血清的RP-MI-1640完全培养基.
1.4 总RNA提取 取约5×106 新鲜HL-60细胞，用TRIzol○R 试剂盒提取总RNA.总RNA沉淀溶于100μL DEPC处理水中，-80℃保存.
1.5 RT┐PCR
1.5.1 RT 模板总RNA5μL，Oligo dT为引物，83.35nkat AMV逆转录酶作用下合成cDNA.20μL逆转录反应体系，42℃反应60min，99℃灭活5min.
1.5.2 PCR1 取5μL逆转录产物为模板，以P1，P2为引物，扩增TLR2胞外域加跨膜段cDNA片段.反应参数为:95℃预变性10min，94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸120s，共32个循环，最后72℃延伸10min.
1.5.3 PCR2 取5μL PCR1产物为模板，以P1，P3为引物，扩增TLR2胞外域cDNA片段.反应参数同PCR1.
1.5.4 PCR3 取5μL模板（PCR2产物成功克隆至pGEM-T Easy载体所得到的质粒），以P1，P4为引物，扩增TLR2胞外域N端片段.反应参数为:95℃预变性10min，94℃变性60s，55℃退火90s，72℃延伸120s，共32个循环，最后72℃延伸10min.
1.5.5 PCR4 以P5，P6为引物，扩增TLR2胞外域C端片段.模板及反应参数同PCR3.
1.5.6 PCR反应产物的鉴定 取PCR反应产物5～10μL，加适量溴酚蓝，以10g・L-1 琼脂糖凝胶电泳鉴定.
1.6 PCR产物的克隆与真核表达载体的构建 PCR产物经电泳鉴定后，以试剂盒回收目的片段，并与pGEM-T Easy载体直接连接，转化E.coli JM109，涂平板后培养过夜，挑出阳性菌落，小量扩增，快速抽提质粒.质粒经BamHⅠ+XhoⅠ双酶切或EcoRⅠ单酶切后，以琼脂糖凝胶电泳鉴定.阳性质粒与pcDNA3质粒均使用BamHⅠ+XhoⅠ双酶切并电泳后，进行回收、连接、转化、筛选和鉴定等步骤，直至获得目的片段的真核表达载体.PCR3和PCR4产物的克隆及真核表达载体构建同上.上述过程参照试剂盒说明书及文献［6-8］进行.
1.7 序列分析 测序由上海Sangon公司进行，测序引物为pGEM-T Easy载体上的T7和Sp6.一次双向测序未测通的长序列所需的额外测序引物由Sangon测序部自行设计合成.以Bioedit软件及ANTHEPROT蛋白序列分析软件包分别对测序结果与U88878序列的核酸和氨基酸序列进行比较分析.
2 结果
2.1 半巢式RT┐PCR获取TLR2胞外域cDNA片段 RT-PCR终产物（即PCR2产物）经电泳鉴定后，可见1条约1776bp的DNA条带，与预期相符（Fig2）.
图2 略
2.2 TLR2cDNA胞外域的克隆与鉴定 RT-PCR产物与pGEM-T Easy载体连接得到的阳性克隆，经BamHⅠ+XhoⅠ双酶切后电泳鉴定显示，除切下约3000bp的载体片段外，还有1个约1776bp的插入片段，它与PCR产物及目的基因片段长度相符.因而，初步确定得到了1个预期的cDNA克隆，并命名为pGEM-Tex.继而将pGEM-Tex中的目的片段插入pcDNA3载体.经初步鉴定，获得了1个TLR2胞 外域的pcDNA3真核表达载体，并命名为pcDNA-Tex，其双酶切鉴定结果见Fig3.
2.3 TLR2胞外域N端和C端片段的扩增与克隆 TLR2胞外域N端和C端片段的PCR产物克隆分别命名为pGEM-NTex和pGEM-CTex.其真核表达载体分别命名为pcDNA-NTex，pcDNA-CTex，其双酶切鉴定结果见Fig4.
图3 － 图4 略
2.4 序列分析 上述阳性克隆均进行全长测序.为确保序列较长者测序准确，采用T7和Sp6双向测序，以相互校正.pGEM-Tex共测序4次方测通.其结果拼接后，与U88878序列的对齐结果见Fig5.分析显示，二者除4个碱基不同外，其余序列完全相同，同源性高达0.998.近N端有3个碱基不同（以U88878序列为参照，分别为A252G，T305A和A331T），近C端见1个碱基不同（T1764C）;此外未见任何其他差异.证明所克隆的序列确实为TLR2胞外域. 252位密码GGA变为GGG，编码产物仍是Gly;305位密码CTG变为CAG，编码产物Leu变为Gln;331位密码AGC变为TGC，编码产物Ser变为Cys;1764位密码ACT变为ACC，编码产物仍为Thr.可见，编码产物将有2个氨基酸残基不同.使用ANTHEPROT蛋白序列分析软件包对其编码产物的二级结构和一些理化特性进行了预测和比较，包括信号肽、抗原性、亲水性、疏水性、可溶性，等电点分析以及α螺旋等二级结构预测等.结果表明，除上述2个氨基酸不同造成的氨基酸组成方面的微小变化外，未见其他差别.
另外，pGEM-NTex和pGEM-CTex与pGEM-Tex完全一致，未见新的变化，符合预期结果;其中近N端的3处差异位于pGEM-NTex中;近C端的1处差异位于pGEM-CTex中.本课题所克隆的TLR2胞外结构域的基因序列已收录GTenBank
图5 略
3 讨论
近两年的天然免疫研究中，人类TLR家族倍受关注.Toll最早是作为果蝇胚胎背-腹模式形成系统的一个成分于1985年发现的，继而发现其在果蝇的天然免疫反应中发挥重要作用［1，2］ .TLRs属于胚系基因编码的天然免疫识别分子，在对PAMPs的天然免疫反应中，是关键的信号转导受体，关系到如脓毒性休克、风湿性关节炎和哮喘等人类疾病的发生［3，9］ .目前至少已知9种人类的Toll类似物 TLRs，其天然配体尚不太清楚，但似乎TLRs均可参与天然免疫反应.TLRs主要通过NF-κB途径引起系列特定基因的表达［10-13］ . 人TLR2基因位于4号染色体（4q32），主要表达于骨髓单核细胞.其配体较广泛，包括PGN，LTA和脂蛋白等大部分已知的PAMPs［4，5，14-16］ .其胞内结构域突变体以及单抗抑制其信号转导的研究说明了其胞外域在配体识别中的重要性，进而显示出TLRs胞外域在相应疾病防治中的前景［17，18］ .
TLRs属于富含亮氨酸蛋白家族成员.LRR基序分布广泛，负责介导蛋白质-蛋白质相互作用，细胞粘附及信号转导.LRR在TLRs中的确切作用尚不清楚.我们正是基于LRR在TLR2胞外域中集中分布的特点，选取了完整的TLR2胞外域，及其中LRR更为集中的近N端片段和近C端片段三者作为研究对象，以期深入了解其识别配体的分子机制.此外，由于TLR2与TLR4的胞外域有较高同源性，且二者在PAMPs的识别机制中的关系尚不明了，本研究也将有助于对TLR家族及其他成员的理解.HL-60细胞TLR2胞外域及其N端和C端片段的克隆成功，为探索TLR2的结构―功能关系，进而为制备重组的人TLR2制剂，寻求细菌感染性疾病以及其他有关疾病有效的诊断和防治手段等奠定了基础.此外，作者所获得的克隆与U88878序列的差别是RT-PCR引入的还是HL-60细胞本身所固有的，以及是否影响产物的功能，有待进一步研究.
致 谢 剑桥大学遗传学部FlyBase（Cambridge）的Heather Butler博士以及果蝇研究专业网站FlyBase（http://fly.ebi.ac.uk:7081/）提供的关于命名的资料.
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