作者：刘贺亮 崔大祥 王禾 陈宝琦 邵国兴 陈勇
【关键词】 载体构建
关键词: FasL基因;载体构建;细胞凋亡;细胞株
摘 要:目的 构建含FasL基因的腺病毒载体，转染肾癌GRC-1细胞株，观察FasL基因对GRC-1细胞株的影响. 方法 以腺病毒作载体，把FasL基因克隆入腺病毒载体，构建成含FasL基因的转基因载体并酶切鉴定，用脂质体包裹法把含FasL基因的腺病毒载体转染GRC-1细胞株，用RT-PCR方法证实转染后有无FasL基因表达，采用电镜观察GRC-1细胞形态学变化. 结果 酶切鉴定证实含FasL基因的转基因载体构建成功;RT-PCR显示转染后GRC-1细胞株FasL基因表达水平显著高于未转染细胞株（P&<0.01）;肾癌细胞株GRC-1转染FasL基因72h后，在光镜下可见细胞体积缩小，生长不良，染色质浓缩，密度增高，胞核中出现颗粒样物质，电镜下可见凋亡小体. 结论 成功构建了FasL基因的转基因载体;转染FasL基因可诱导肾癌GRC-1细胞凋亡.
Keywords:FasL gene;construction;vector;apoptosis;cell line
Abstract:AIM To construct adenovirus vector with FasL，transfer vector into GRC-1cell line，and observe FasL effects on GRC-1.METHODS Using adenovirus as vector，cloned FasL gene into vector and identified if FasL gene was cloned into vector by using enzyme digestion;using Lipofectin to pack vector with FasL，transferred vector into GRC-1cell line，and then observed morphological change of GRC-1cell.RESULTS ①FasL gene was cloned into adenovirus vector by using enzyme cutting;②After72hours after transferring FasL gene into GRC-1cell line，FasL gene was higher ex-pression level than untransferred cells;③Condensation of chromosome and apoptosis body were observed by electro┐scope.CONCLUSION Adenovirus Vector with FasL gene was sucessfully constructed;transferring FasL into GRC-1cell may induced GRC-1cell line to display cell apoptosis.
0 引言
基因治疗前景诱人［1］ .Fas/FasL系统在维持细胞群体数量稳定，消除恶性转化细胞及调节免疫系统的功能中发挥重要作用［2，3］ .研究FasL在肾癌治疗中的作用具有重要意义.本研究拟构建FasL真核转基因表达载体，然后转染肾癌细胞株GRC-1，并对转染后的肾癌细胞株进行形态学观察，拟探讨转染的FasL基因对肾癌细胞的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 含FasL基因的质粒与腺病毒载体由西京医院陈勇教授惠赠;GRC-1肾癌细胞株由第四军医大学实验动物中心提供;1640培养基，Gibco产品，胎牛血清、限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq酶均购自原平公司，Lipofectin为Gibco产品.
1.2 方法
1.2.1 表达载体的构建与鉴定 采用HindIII与BamHI双酶切含FasL的pCMV质粒，回收片段;采用HindIII与BamHI双酶切腺病毒载体，回收切开的载体;产物与载体的连接、转化、过夜，挑阳性克隆按文献［4-6］进行;提取质粒并用HindIII与BamHI双酶切鉴定.
1.2.2 细胞培养 GRC-1细胞株接种于含有100mL・L-1 胎牛血清的RPMI1640培养基中，在37℃，50mL・L-1 CO2 条件下，连续培养.细胞分为3组:①GRC-1细胞对照组;②转染了空载体的细胞;③转染了重组FasL基因的载体.
1.2.3 肾癌GRC-1细胞的转染 把4μg质粒DNA溶于不含血清的RPMI1640100μL中即为A液，取10μL lipofectin溶于不含血清的RPMI164090μL中即为B液.15min后，混合A与B液，同时取处于对数生长期的GRC-1细胞1×106 个，用PBS洗两次，重悬于0.8mL无血清培养液中.把A，B混合液加入到0.8mL重悬的细胞中，37℃，50mL・L-1 CO2 条件下培养6h之后，再继续培养72h.
1.2.4 表达水平的检测 按照文献［6］要求，提取转染前细胞株与转染后细胞株总RNA，定量后采用定量PCR方法进行表达水平鉴定，PCR引物为:P1:5’-CCAAGCTTATGCAGCAGCCC TTC-3’，P2:5’-ACGGATCCGCTCTCCGGT-3’.
1.2.5 透射电镜标本制备 1×106 细胞PBS洗2次，离心后弃培养液，沿管壁缓慢加40g・L-1 戊二醛，4℃冰箱固定，常规电镜，脱水，包埋，超薄切片，铀铅染色.观察，拍照.
2 结果
2.1 表达载体的构建与酶切鉴定 提取质粒后，用HindIII与BamHI双酶切后进行12g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，证实转基因载体构建成功（Fig1）.
2.2 转染细胞株后表达水平检测 转染后的细胞株FasL基因表达水平显著高于未转染细胞株（Fig2）. 2.3 电镜观察结果 转染72h后，在光镜下可见，凋亡细胞体积缩小，生长不良，染色质浓缩，密度增高，胞核中出现颗粒样物质，可能是固缩的染色质碎片.在电镜下可见染色质凝集、溶酶体扩张等凋 亡特征（Fig3），证实转染FasL基因可诱导肾癌细胞凋亡.
图2 － 图3 略
3 讨论
Fas单抗诱导肿瘤细胞凋亡已被大量实验证实［5，6］ ，但转染FasL基因到肿瘤细胞中并使得FasL基因呈高表达，这能否诱导细胞凋亡，还未见报道.最近的研究表明［7］ ，肿瘤细胞通过Fas途径诱导T淋巴细胞凋亡，逃避免疫监视.GRC-1细胞株中FasL呈低表达，Fas呈中等水平表达，Fas单抗可诱导GRC-1细胞凋亡.我们成功地构建了FasL转基因载体，转染GRC-1细胞株后，用反转录PCR方法证实了FasL呈高水平表达，继续培养细胞株72h，采集肿瘤细胞，形态学观察与电镜扫描观察，都证实存在细胞凋亡的典型特征.因此，我们认为，用Fas单抗治疗或使Fas高表达是诱导肿瘤细胞凋亡的一条有效途径，但转染FasL基因诱导肿瘤细胞凋亡可能也是一条值得探索的治疗肿瘤的途经.
Fas/FasL系统与移植排斥反应密切相关，与细胞免疫调节密切相关［8］ .大量实验证实癌患者血清中存在一定量的可溶性Fas.如果通过转基因的方法使得FasL在肿瘤细胞表面大量表达，FasL与可溶性Fas结合，可直接诱导肿瘤细胞凋亡或生理改变.我们的结果初步证实了这一点.文献表明，肿瘤细胞通过Fas系统诱导T细胞凋亡，反击T细胞.T淋巴细胞在接受抗原刺激后进入活化期，克隆增殖后的T细胞大量表达Fas，对肿瘤细胞表达的FasL非常敏感，与之结合，在杀死肿瘤细胞的同时，也导致本身细胞死亡.
参考文献
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