【关键词】 皮肤;β-防御素-3
关键词: 皮肤;β-防御素-3;逆转录聚合酶链反应
摘 要:目的 克隆人β-防御素-3的基因. 方法 提取人皮肤组织的总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用PCR的方法克隆人β-防御素-3基因.PCR产物连接入pGEM-T-EASY载体，转化DH-5α感受态细胞，蓝白筛选，对酶切及PCR鉴定含有目的片段的克隆进行测序. 结果 获得预期大小的PCR产物，经序列鉴定证实为人β-防御素-3基因. 结论 获得了人β-防御素-3基因.
Keywords:skin;hBD-3;reverse transcriptase polymerase chain reaction
Abstract:AIM To clone the gene encoding humanβ-de-fensin-3.METHODS Total RNA was extracted from hu-man foreskin tissue and complementary DNA was made by reverse transcription as template for polymerase chain reac-tion.PCR product of expected size was then inserted into pGEM-T-EASY cloning vector.Recombinant pGEM-hBD-3vector was transduced into competent cell DH-5α.Restriction analysis and PCR were performed to identify the clone con-taining the DNA fragment of interest，followed by sequencing with ABI CEI sequencer.RESULTS We obtained a259bp DNA fragment that is identical to the hBD-3cDNA sequence registered in GenBank.CONCLUSION hBD-3gene is suc-cessfully cloned from human foreskin tissue.
0 引言
为适应生存的外部环境，自然界中的每种生物都发展出了一套有效的防范机制.近年来从许多生物物种的体内都相继发现了一系列内源性的抗微生物短肽（antimicrobial peptide），如Cecropin样抗菌肽、富含Pro残基的抗菌肽、含Gly残基的抗菌肽、富含Cys残基的抗菌肽以及杀菌通透性增加蛋白［1-3］ ，其中富含Cys残基的碱性抗菌肽被命名为防御素（de-fensin）［4］ .这些短肽分子中含有3～4对二硫键，具有独特的稳态结构和广泛的生物学活性，尤其是对细菌等病原微生物广谱的杀伤作用，而备受人们关注.已知的防御素依其结构特征和来源不同，分为四种类型，即α-防御素、β-防御素、昆虫防御素和植物防御素.研究表明，上皮细胞是防御素的一个主要来源.近年发现的β-防御素-1和2（humanβ-defensin1，2，hBD-1，2）在上皮细胞中有着广泛的分布，是机体重要的内源性生物防御素屏障［5，6］ .根据最新研究报道，德国学者Harder等［7］ 又从人牛皮癣的皮肤组织中纯化到β-防御素家族的新成员 hBD-3.该蛋白对革兰氏阳性菌具有高效而广谱的杀伤作用.
1 材料和方法
1.1 人皮肤总RNA的提取及cDNA的合成 临床获取正常人新鲜包皮组织约150mg，用TRIzol试剂（Gibco BRL）提取总RNA，操作按使用说明进行.取2μg总RNA进行反转录（Omniscript RT kit，Qi-agen）.反应条件为:60℃2min;30℃30min;80℃2min.
1.2 PCR反应 根据GenBank报道的hBD-3的cDNA序列设计一对引物，以反转录产物为模板，采用Taqplus DNA聚合酶（Sangon）进行PCR反应.引物由赛百盛公司合成，其序列为:5’CGGGATC CTGGGTCTCAGCG;3’GGAATTCCACTCTCG-TCATG.引物5’端加上BamHI酶切位点，并设计CG两个保护碱基，3’端加上EcoRI酶切位点，并设计一个G作为保护碱基.在200μL PCR专用薄壁管（Promega）中依次加入10×PCR缓冲液5μL，dNTPs10pmol，引物各25pmol，cDNA2μL，Taqplus DNA polymerase（Sangon）5u，去离子水补充反应体积至50μL.按以下程序进行PCR反应:94℃5min;94℃20s，51℃20s，72℃20s，35循环;72℃30min.产物在20g L
-1 琼脂糖凝胶上电泳.
1.3 PCR产物回收 从胶上切下含目的片段的电泳条带，用Advantage PCR-Pure Kit（Clontech）回收，操作按使用说明书进行，回收体积为20μL.
1.4 连接反应 取PCR产物3μL，pGEM-T-EASY载体（Promega）1μL，2×Buffer5μL，DNA连接酶1μL，在1.5mL微量离心管中混匀，16℃过夜.
1.5 重组质粒转化DH┐5α感受态宿主菌 采用CaCl2 法常规制备DH-5α感受态宿主菌［8］ ，与连接产物在冰水中共浴30min，42℃水浴中休克90s，加入不含氨苄的LB培养基800μL，置37℃45min，离心弃上清，留约100μL残液，加入IPTG和X-gal各15μL，混匀并使菌体重悬，均匀涂布于含氨苄青霉素（100mg L-1 ）的LB平板上，37℃过夜.
1.6 重组质粒的筛选及鉴定 从平板中随机挑选数个白色克隆，接种于3mL含氨苄青霉素（100mg L-1 ）的LB液体培养基中，固定在37℃摇床上，200r min-1 震荡培养过夜.取1.5mL菌液离心收集菌体，采用华舜小量质粒抽提试剂盒提取质粒，用EcoRI单酶切及PCR鉴定.酶切条件为:质粒8.5μL，10×Buffer1μL，EcoRI（Gibco BRL）2u，37℃，2h.PCR条件如前，其中质粒经100℃水煮变性5min后作为模板.
1.7 测序 含有目的插段的质粒在PE317-A型DNA自动测序仪上（Perkin Elmer，USA）测序.
2 结果
2.1 皮肤总RNA的提取 从150mg包皮组织中获得20μL总RNA，浓度为2.97g L-1 ，A260nm /A280nm比值为1.81.
2.2 RT┐PCR 以皮肤组织总RNA反转录产物为模板进行PCR，在20g L-1 琼脂糖凝胶上电泳，出现预期单一条带，大小约200～300bp（Fig1）.
图1 略
2.3 PCR产物鉴定 重组质粒采用EcoRI酶切和PCR鉴定（Fig2）.
图2 略
2.4 测序结果 PCR产物序列如下:CGGGATCCTGAGTCTCAGCGTGGGGTGAAGCCTAGCAGCTATGAGGATCCATTATCTTCTGTTTGCTTTGCTCTTCCTGTTTTTGGTGCCT
GTCCCAGGTCATGGAGGAATCATAAACACATTACAGAAATATTATTGCAGAGTCAGAGGGGCCGGTGTGCTGTGCTCAGCTGCCTTCCAAAGGAGGAACAGATCGGCAAGT
GCTCGACGCGTGGCCGAAAATGCTGCCGAAGAAAGAAATAAAAACCCTGAAACATGACGAGAGTGGAATTCC测序结果经序列同源性分析证明，所获得的259 bp PCR产物为预期的hBD-3序列，与文献报道结果完全一致，序列覆盖编码区全长.
3 讨论上皮组织是机体抵御各种微生物侵袭的第一道屏障.近年研究发现，人体上皮细胞能够分泌一些多肽类物质，这些多肽能够在细菌等致病微生物的胞膜上形成孔隙，导致其胞膜内外水电解质失衡，从而对这些致病微生物起到杀伤作用［9］ .这些生物短肽因其广泛的靶细胞谱和强效的杀伤作用而使人们看到了应用其于临床治疗感染性疾病，从而解决当前日趋严峻的细菌抗生素耐药性问题的广阔前景.
1995年，Bensc等［10］ 从人血滤出液中纯化到了第一个β-防御素蛋白hBD-1.1997年，Harder等［6］ 又从牛皮癣皮肤组织中纯化到了hBD-2.hBD-1和hBD-2都主要在上皮组织中表达，但hBD-1在组织中持续性表达，而hBD-2则主要出现在病灶区域，在皮肤、肺等上皮组织受到TNF-α，IL-1β刺激或直接与细菌荚膜等接触时，成诱导型表达［11，12］ .现有研究表明，hBD-1和hBD-2的抗菌活性主要是针对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、绿脓杆菌等，而对革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌则作用较弱，而这些细菌正是引起皮肤脓肿、心内膜炎等疾病的主要元凶［13］ .根据Harder等［7］ 的最新报道，该课题组采用金黄色葡萄球菌亲合柱，从人牛皮癣组织提取物中纯化到了β-防御素家族的新成员 hBD-3.该蛋白与hBD-1和hBD-2不同，主要作用于金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌等革兰氏阳性菌，但与hBD-2一样可在转录水平上受病原微生物调节，TNF-α，细菌刺激等可诱导其表达.其mRNA在皮肤和扁桃体中高表达，而在呼吸道、小肠粘膜和泌尿生殖道中表达较低，甚至不表达.
hBD-3杀菌活性的作用机制可能与已知的各种防御素不同.扫描电镜研究发现，hBD-3作用后的金黄色葡萄球菌，其表面出现与青霉素作用后相类似的形态学变化，后者能够破坏细菌胞壁的肽聚糖交联，而α-防御素等主要是依靠其分子带正电荷的两性分子的特征在细菌胞膜上形成孔道，因而出现层状的、间体样的结构.hBD-3对细菌杀伤作用的确切机制还有待于进一步研究.
hBD-3的mRNA全长337个碱基，编码22个氨基酸的信号肽和45个氨基酸的成熟肽.与hBD-1和hBD-2相同，hBD-3的分子中同样含有6个半胱氨酸，形成3对二硫键.不过，不同的是，将hBD-3在大肠杆菌中作融合表达，产物经酶切与融合蛋白分离后可获得与化学合成或天然提取蛋白相同的生物活性.而既往研究表明，在细菌宿主中表达抗微生物肽非常困 难，且表达产物因其分子中3对二硫键的存在而难以形成正确的空间折叠，影响活性.
我们采用RT-PCR的方法，从人皮肤组织中克隆到了hBD-3的cDNA，并在其两端设计了酶切位点，为进一步构建表达载体，表达hBD-3蛋白，获取其基因工程产品进行动物及临床抗感染治疗打下了基础，同时也为深入探讨hBD-3的作用机制提供可能.
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