作者：余厚友 宋祖军 袁顺书 刘彦仿 杨守京
【关键词】 肝肿瘤
关键词: 肝肿瘤;细胞株;热休克蛋白72;克隆;基因表达
摘 要:目的 克隆人热休克蛋白72（HSP72）基因，原核表达并纯化蛋白产物，以探讨其生物学功能. 方法 从热休克的人肝癌细胞株SMMC-7721中，用RT-PCR方法扩增得到HSP72基因并克隆到原核表达载体pQE-30中，在大肠杆菌JM109中用IPTG诱导下表达的蛋白经FPLC梯度洗脱和Sephacryl S200凝胶过滤纯化，经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上，用anti-HSP72单抗作探针，进行Western blot鉴定. 结果 克隆的基因序列分析结果与有关报道一致，所构建的pQE-30HSP72载体在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的Mr 为72000的蛋白，经鉴定确系HSP72蛋白. 结论 克隆了人HSP72基因，并对该基因进行了原核表达与纯化，为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础.
Keywords:liver neoplasms;cell line;heat shock protein72;cloning;gene expression
Abstract:AIM To clone human heat shock protein72（HSP72）gene，do prokaryotic expression and purify HSP72protein for further study.METHODS Human HSP72gene was obtained by RT-PCR from heat shocked human hepato-carcinoma cell line SMMC-7721.Its product was recombined in vitro with prokaryotic expression vector pQE-30and was transformed to E.coli strain JM109.The proteins，expressed in E.coli strain with HSP72recombinant plasmid under IPTG induction，was obtained by FPLC and Sephacryl S200chro-matography and characterized by SDS-PAGE and Western-blot-confirmed with anti-HSP72McAb.RESULTS The HSP72gene was cloned and identified to be consistent with relevant reports.The HSP72with a molecular weight of72000was highly expressed in pQE-30HSP72.Western blot proved that the expressed product had the antigenicity of HSP72.CONCLUSION The establishment of a series of methods for the cloning，expression and purification of HSP72gene will assist in the structural and functional char-acterization of HSP72.
0 引言
热休克蛋白（HSP）是生物体（或离体的培养细胞）在不良环境因素作用下（如缺血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病毒感染、DNA损伤等）所产生的一组特殊蛋白质，对细胞损伤有保护作用.其生物学功能很广泛，在细胞生长、发育、分化过程中参与基因转录、蛋白质合成、折叠、跨膜运输、分解和立体构象的维持并发挥重要作用，属分子伴侣蛋白［1］ .热休克蛋白72（HSP72）是HSP中最保守和最主要的一类.近年来发现很多疾病的发生、发展均与其有关，有必要进一步了解其生物学功能.我们克隆了人HSP72基因，并在大肠杆菌内对该基因进行了诱导表达，建立了一套完备的纯化方法，为进一步研究提供了条件.
1 材料和方法
1.1 材料 人肝癌细胞株SMMC-7721和受体菌JM109由本室保存.测序质粒载体pUC19和原核表达质粒pQE-30由中山医科大学叶苓博士惠赠.EcoR I，Pst I，T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自NSBC Sangon公司.DNA Marker、蛋白质相对分子质量标准和anti-HSP72单抗购自Gibco公司.IPTG、细胞总RNA提取试剂盒和质粒提取纯化试剂盒为Promega公司产品.cDNA第一链合成试剂盒购于华美生物公司.
1.2 方法
1.2.1 PCR引物的设计 根据GeneBank中已报道的人HSP72基因序列，设计了一对PCR扩增引物，并在片段的5’及3’端序列引入HSP72基因内部没有的新的酶切位点EcoR I和Pst I以便于基因的酶切和定向克隆.P1:5’cggattcATGGCCAAAGC-CGCGGCG3’;P2:5’cgctcgagATCTACCTCCT-CAATGGT3’.
1.2.2 人HSP72基因的扩增 人肝癌细胞株SMMC-7721经42℃热休克2h，于休克后16h［2］ 根据试剂盒说明提取细胞总RNA，反转录合成cDNA第一链，以其为模板PCR扩增HSP72目的片段.反应条件:去离子水37μL，cDNA1μL，引物各1μL，10×buffer5μL，25mmol・L-1 dNTP1μL，10mmol・L-1 MgCl2 3μL，混匀，94℃变性5min，冰浴1min后，加入Taq DNA聚合酶1μL.PCR仪扩增，反应参数:先95℃预变性5min，然后按94℃1min，55℃1min，72℃2min的条件进行35个循环，最后72℃延伸10min.
1.2.3 HSP72基因的克隆与测序 经PCR扩增后，扩增产物在10g・L-1 琼脂糖凝胶上电泳鉴定.将质粒pUC19和目的片段经EcoR I和Pst I双酶切，回收载体和目的片段，在T4DNA连接酶作用下12℃过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切分析和PCR扩增鉴定后行全基因的全自动序列分析.
1.2.4 HSP72基因的原核表达 从经测序鉴定后的pUC19-HSP72中EcoR I和Pst I双酶切回收HSP72目的基因片段，并与经同样限制酶双酶切的原核表达质粒pQE-30相连接，建立原核表达载体pQE-30HSP72，转化大肠杆菌JM109，挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切鉴定后将含有表达载体的单一菌落在LB培养基（含100mg・L-1 氨苄青霉素）中过夜培养，然后转接至新的10g・L-1 LB肉汤管（含2g・L-1 葡萄糖、100mg・L-1 氨苄青霉素）中，继续培养至A值约为0.4～0.6，37℃加诱导剂IPTG至终浓度为1mmol・L-1 ，取诱导0，0.5，1，2，3和4h各组样品，SDS-PAGE检测表达产物，并用anti-HSP72单抗作Western blot鉴定其抗原性［3］ .
1.2.5 HSP72蛋白的纯化和鉴定 pQE-30HSP72转化的JM109菌经培养和IPTG诱导表达后，12000g离心5min收集沉淀、经30mmol・L-1 NaHCO3
（pH7.4）溶液4℃低渗30min，12000g离心15min 取上清，PEG20000浓缩后过FPLC离子交换柱［4］ ，梯度洗脱，收集峰值蛋白液;浓缩后分别过Sephacryl S200凝胶柱，收集峰值蛋白液;纯化蛋白液分别用SDS-PAGE检测相对分子质量，并用anti-HSP72单抗作探针，进行Western blot鉴定其抗原性.
2 结果
2.1 人HSP72基因的克隆与测序 经PCR扩增后，扩增产物在10g・L-1 琼脂糖凝胶上电泳鉴定结果表明，从人肝癌细胞株SMMC-7721扩增得到了长度约1.9kb的DNA片段（Fig1）.克隆基因的全自动序列分析结果与GeneBank所报道的人HSP72基因序列相一致.
图1 重组pQE-30HSP72载体DNA酶切后电泳图 略
2.2 重组原核表达载体的构建与鉴定 重组原核表达载体pQE-30HSP72转化大肠杆菌JM109后，经质粒提取和10g・L-1 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，用EcoR I酶切的A组，在5400bp处有一条带，经EcoR I和Pst I双酶切的B组，在1900bp处和3500bp处各有一条带（Fig1）.
2.4 纯化蛋白的鉴定 经FPLC梯度洗脱和Sephacryl S200凝胶过滤纯化的蛋白，经SDS-PAGE检测在Mr 72000处有一条带，用anti-HSP72单抗行Western blot鉴定在Mr 72000处有一抗体结合带（Fig3）.
图2 － 图3 略
3 讨论
HSP72是HSP70家族的主要成员，是热休克蛋白73（HSP73）的类似蛋白，HSP73主要呈结构性表达于几乎所有细胞，而在哺乳动物中正常情况下很难测出HSP72，但在应激反应状态下HSP72会大量合成［5］ .两者不仅相对分子质量相似，其结构、功能及生物学特性也相似.此外，HSP72还具有HSP73所不具有的、尤其是与应激相关的一些功能，如在变性蛋白聚集体的折叠及溶解过程中的“分子伴侣”作用，参与应激时产生的不可逆变性蛋白的转位等［6］ .尽管对HSP72的研究一直很热门，对其作用机制仍知之甚少.现已知HSP72有两个结构域:N末端有一 腺苷酸结合区，具有微弱的ATP酶活性，C末端存在基质识别区，可与短的多肽非共价结合［7］ .近年来发现HSP72蛋白与自身免疫性疾病、缺血性疾病、癫痫及各类肿瘤等疾病有密切联系［8］ ，因而，对其做深入研究很有必要.我们所用pQE-30是含有T7启动子、终止子和抗Amp基因等的高表达原核载体.HSP72基因全长约1900bp，重组的基因图长约5400bp.JM109菌株是Amp（―）菌株，当重组载体转入后，由于含有抗Amp基因，转化的细菌就能在Amp（+）的琼脂平板上生长.从转化菌中提取的质粒，经单独酶切得到的5400bp基因片段与重组载体长度一致，经双酶切得到的3500bp片段为pQE-30的基因，另一1900bp基因片段为人HSP72基因，因此重组载体的构建与设想一致.
本结果显示，转化菌株在IPTG的诱导下能产生Mr 为72000的蛋白，且随时间延长表达产物明显增多.用anti-HSP72单抗Western blot法检测证明，该蛋白具有HSP72抗原特异性，因而该转化菌株表达产物为HSP72.而转入pQE-30的对照组无明显表达Mr 70000的蛋白，也不随诱导时间延长而变化.取诱导2h后的细菌低渗裂解液，经FPLC分离后共获8个蛋白洗脱峰，其中第3，5峰洗脱液中富含HSP72蛋白，但尚含有较多的Mr &<60000的其他蛋白，此两峰蛋白样品经Sephacryl S200进一步分离，电泳结果表明，获得纯度较高的M r 为70000的目的蛋白Western blot进一步证实为HSP72.为进一步研究HSP72的结构和功能及临床应用奠定了基础.
参考文献:
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