作者：郑奇军 蔡振杰 俞世强 杨光 胡军 胡巧侠
【关键词】 急性梗死
关键词: 心肌/细胞学;急性梗死;新生血管化，病理性;移植
摘 要:目的 观察移植的胚胎心肌细胞在成年兔急性梗死心肌组织内的生长发育过程和其与宿主心肌组织的相互作用，以及对周围心肌血运的影响. 方法 将培养的兔胚胎心肌细胞，经DAPI标记后，直接注入成年兔的急性梗死心肌组织内（通过结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型），同时设立对照组.4wk后处死动物，进行组织学和电镜观察. 结果 4wk后的心肌组织切片中，移植心肌细胞与宿主心肌细胞之间形成闰盘，其排列方向与宿主心肌肌纤维方向平行，同时，与对照组相比，心肌梗死区面积减少及移植区血管密度增高（P&<0.05）. 结论 移植的胚胎心肌细胞在受体急性梗死心肌内可以继续生长发育，逐渐分化成熟，从而稳定病损的心肌结构，改善心脏的收缩功能，同时，对改善周围血供起到积极作用.
Keywords:myocardium/cytology;myocardial infarction;neovascularization，pathologic;transplantation
Abstract:AIM To investigate the interaction between im-planted fetal cardiomyocytes and host cardiomyocytes and the angiogenesis effects of implanted fetal cardiomyocytes on the host cardiomyocytes and the development of fetal cardiomy-ocytes implanted into adult acute infarction myocardium.METHODS After labelled with DAPI，cultured rabbit fetal cardiomyocytes were implanted into the actue myocardial in-farction site of adult rabbits via direct injection.The myocar-dial infarction model was established by ligating the left ante-rior decending artery.Specimens were harvested4weeks af-ter the cell implantation.The results were observed by histo-logic methods and electronic microscopy examination.RE┐SULTS Intercalated disks were observed between the graft-ed and the host cardiomyocytes，with the implanted car-diomyocytes parallel to the host myocardium in an aligning di-rection.The area of myocardial infaction decreased and the vascular density of implantationsites increased compared with those of the control groups（P&<0.05）.CONCLUSION The fetal cardiomyocytes，after being implanted into the acute myocardial infarction，can differentiate into mature car-diomyocytes in the host heart，which not only repair the structure of the damaged cardiomyocytes and improve the systolic function of the host heart，but also induce angiogene-sis in the core of the infarct.
0 引言
将体外培养的兔胚胎心肌细胞直接移植到成年兔急性梗死区的心肌内，分别观察研究其在受体心肌组织内的生长发育和与宿主心肌细胞的相互作用情况，以及对周围心肌血运的影响，验证细胞移植治疗缺血性心脏病的作用，为临床上应用细胞移植治疗缺血性心脏病提供实验基础.
1 材料和方法
1.1 材料 成年健康兔18只，雌雄不限，体质量2.0～2.5kg，购自第四军医大学实验动物中心.小牛血清（Hyclone），DMEM高糖培养基（Hyclone），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡盐液（Gibco），4’，6-二脒基-2-苯茚二酮（Sigma），第Ⅷ因子抗体（Sigma）.
1.2 方法
1.2.1 胚胎心肌细胞的分离和培养［1-3］ 取胚胎兔浸入950mL L-1 乙醇30s，取出心脏，分离心室，用培养液洗涤2次，将心室肌肉剪碎，加入0.25g L-1 胰蛋白酶消化30min，反复吹打，室温下540g离心5min，收集消化的细胞，用含100mL L-1 小牛血清的DMEM培养液，置37℃含50mL L-1 CO2 孵箱中培养2h，然后将培养瓶翻置，将未贴壁的心肌细胞继续培养，2d换液1次.
1.2.2 胚胎心肌细胞标记 心肌细胞培养第4日，用0.2g L-1 4’，6-二脒基-2-苯茚二酮（DAPI）荧光标记细胞4h以上，用Hanks平衡盐液漂洗6次以去除未结合的DAPI.0.25g L-1 胰蛋白酶消化后，离心收集细胞，加入DMEM培养液制成细胞悬液（细胞密度为104 μL-1 ），以备用于细胞移植.
1.2.3 兔急性心肌梗死模型的建立及细胞移植 将健康兔随机分成胚胎心肌细胞移植治疗组及对照组.用戊巴比妥钠30mg kg-1 iv，氯胺酮10mg kg-1 im麻醉.左前外侧切口，切断第3，4肋骨进胸，显露左冠状动脉前降支，距离其根部大约1.0～1.5cm，用4-0普理林线直接缝扎，见其远端供血区心肌组织颜色发暗，急性心肌梗死模型即告成立.1h后，用微量注射器向梗死区心肌组织内注射移植用心肌细胞悬液，3点注射，每处50μL，对照组以相同量的DMEM细胞培养液注射.常规关胸，抗感染治疗，每日给予环孢素A10mg kg-1 饲养.手术中未发生气胸及恶性心律失常.
1.2.4 结果观察 心肌细胞移植术前，动态观察培养的心肌细胞，荧光显微镜观察用DAPI标记好的心肌细胞.心肌细胞移植术后4wk，用过量麻醉剂处死动物，取移植区及周围心肌组织，统计梗死区面积，制作标本，进行透射电镜及冰冻切片荧光显微镜观察.同时，对梗死区石蜡切片（治疗组及对照组动物取样2个/只，共取样本36个），用第Ⅷ因子免疫组织化学染色梗死区血管，光学显微镜200倍视野下血管计数，统计移植区血管密度.
统计学处理:数据采用SPLM软件包，运行单因素分析，结果以x ±s表示.
2 结果
2.1 胚胎心肌细胞的特性 对用酶消化法获得的胚胎心肌细胞进行培养，4h后细胞贴壁，24h后可见细胞搏动.培养的心肌细胞成梭形或纺棰形，细胞核大，胞质丰富（Fig1）.
2.2 胚胎心肌细胞移植后心肌再生 治疗组心肌梗死区面积（0.49±0.13）cm2 明显少于对照组（0.96±0.18）cm2 （P&<0.05），心肌细胞移植区可见带有荧光的细胞核及肌纤维，排列方向基本一致，同时，显微光镜下与宿主心肌细胞肌纤维方向平行（Fig2，3）.电镜下，移植细胞线粒体丰富，肌丝排列比较规则，细胞间可见闰盘形成（Fig4）.
2.3 血管再生 对缺血区石蜡切片用第Ⅷ因子行免疫组织化学染色，显微镜200倍视野下血管计数，移植区血管密度（8.0±2.6），高于对照组（1.6±1.4），（P&<0.05）.
3 讨论
正在探索的细胞移植术，为病损性心脏的细胞重构及衰竭心脏的功能恢复，提供了一种全新的治疗策略，为缺血性心脏病的治疗带来了光明的前景.心肌细胞移植可以发挥三大功能:稳定病损性心脏结构，防止组织重构;改善局部或整体心脏的收缩功能;可以充当分子载体，进行基因治疗［4］ .
本实验中，将分离培养的兔胚胎心肌细胞移植到成年兔梗死心肌区域后，心肌梗死区面积明显减少，冰冻切片荧光检测显示，心肌标本中有带荧光的细胞核和肌纤维，说明移植的心肌细胞存活.同时，它们排列方向基本一致，显微光镜下与宿主心肌细胞肌纤维方向平行，这可能与心肌内微环境及宿主心肌细胞收缩时对其产生的机械张力有关［5］ .细胞间形成闰盘是移植的胚胎心肌细胞的结构基础，表明胚胎心肌细胞移植后与宿主心肌细胞融合修复心肌损伤，直接参与了心肌收缩活动.在修复损伤的同时，胚胎心肌细胞还可促进周围血管再生，这可能是由于胚胎心肌细胞在生长发育过程中分泌一些血管生成因子、细胞生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、碱性纤微母细胞生长因子（bFGF）等［6，7］ .实验中我们采用了一种新的细胞标记方法，即利用DAPI标记的方法［8］ ，相对于以前用H3标记、酶标记的方法，其具有以下特点:①DAPI对DNA有高 度亲和力，是标记细胞核的荧光染色，具备标记高效性（100%）.②细胞标记的表达不会因细胞分化状况改变.③一旦被标记后，只由被标记的细胞保存，不会有传递.④对活细胞没有毒性，不会改变细胞活性及细胞器的超微结构.
胚胎心肌细胞移植到成年兔梗死心肌区域后，其细胞膜上离子通道的变化，整块心肌的反应性及全心功能的改善尚待进一步研究.另外，胚胎心肌细胞的异体移植，随着时间的延长，受体内终将发生难以避免的排异反应，进一步寻找自身来源的细胞（如骨髓基质细胞）进行细胞移植的研究正在实验中.
参考文献:
［1］Yu SQ，Reng YS，Wang G，Liu WY，Tang CW.Effects of cap-topril on enzymatology of cultured anoxic-reperfused ventricular myocardial cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（5）:627-629.
［2］Song ZG，Liu WY.Establishment of culturing adult cardiomy-ocytes model with rheumatic heart disease and study on its colla-gen synthesis ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（5）:543-546.
［3］Shang LJ，Zang YM.Cardiotoxicity of CGRP in cultured my-ocardial cells of neonatal rats ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（3）:234-236.
［4］Li RK，Mickle DAG，Weisel RD，Mohabeer MK，Zhang J，Rao V，Li GM，Merante F，Jia ZQ.The natural history of fetal rat cardiomyocytes transplanted into adult rat myocardial scar tissue ［J］.Circulation，1997;96:Ⅱ179～187.
［5］Schwars ER，Patterson M，Kloner RA.Cardiomyocyte trans-plantation-a cell replacement for repair of myocardial infarction ［J］.Z Kardiol，1998;87:1-7.
［6］Li RK，Jia ZQ，Weisel RD，Mickle DAG，Ji Z，Mohabeer MK，Rao V，Ivanov J.Cardiomyocyte transplantation improves heart function ［J］.Ann Thorac Surg，1996;62:654-661.
［7］Redaelli G，Malhotra A，Li BS，Li P，Sonnenblick EH，Hof-mann PA，Anversa P.Effects of constitutive overexpression of insulin-like growth factor-1of the mechanical characteristics and molecular properties of ventricular myocytes ［J］.Circ Research，1998;82:594-603.
［8］Dorfman J，Duong M，Zibaitis A，Pelletier MP，Tim DS，Li C，Chiu RCJ.Myocardial tissue engineering with autologous my-oblast implantation ［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，1998;116:744-751.