【关键词】 肺肿瘤
关键词: 导管消融术;VX2肿瘤;兔;肺肿瘤;脱噬作用
摘 要:目的 探讨射频消融兔肺内VX2肿瘤诱导肿瘤细胞凋亡情况. 方法 采用VX2肿瘤组织块悬液肺内注入法在20只新西兰白兔体内建立兔VX2肿瘤肺内移植模型;实验组12只新西兰白兔给予射频治疗，计数毁损中心区肿瘤组织和边缘区肿瘤组织凋亡细胞指数;对照组8只新西兰白兔，予假性治疗，计数肿瘤组织凋亡细胞指数. 结果 治疗组肿瘤经射频治疗后发生凝固性坏死及细胞凋亡，毁损边缘区肿瘤组织凋亡细胞指数为（345±38），而毁损中心区肿瘤组织凋亡细胞指数为（84±12），两者差异非常显著（P&<0.01）;对照组肿瘤组织凋亡细胞指数为（2.0±0.4），与治疗组毁损区中心组织凋亡细胞指数及毁损区边缘组织凋亡细胞指数相比均相差非常显著（P&<0.01）. 结论 射频消融诱导肿瘤细胞凋亡是射频治疗恶性肿瘤的一项重要机制.
Keywords:catheter ablation;VX2tumor;rabbits;lung neo-plasms;apoptosis
Abstract:AIM To observe status of cell apoptosis of VX2tumor in rabbit lung after radiofrequency ablation.METH┐ODS By injecting VX2tumor tissue suspension in the lung，the transplanted lung cancer model was established in20New Zealand white rabbits.12rabbits were treated with radiofre-quency ablatoin，while another8rabbits were not treated and served as control.Apoptotic index was calculated in the cen-ter tissue of the ablation，fringe tissue of the ablation and tis-sue of the shield ablation respectively.RESULTS Coagula-tive necrosis and cell apoptosis appeared in the tumor after the ablation.Apoptotic index of the fringe tissue of the abla-tion was（345±38），that of the center tissue of the ablation was（84±12）（P&<0.01）and that of the tissue of the shield ablation was（2.0±0.4）（P&<0.01）.CONCLUSION In-ducing cell apoptosis is an important mechanism of radiofre-quency ablation of malignant tumor.
0 引言
经皮穿刺射频消融是一种发展迅速的热损毁技术，在CT、超声、磁共振引导下经皮穿刺置入电极，确定电极位于目标区，启动射频机，射频波经电极尖导入周围组织，产生热量，使组织发生凝固性坏死.该项技术已经应用于灭活骨肿瘤［1］ ，颅内肿瘤［2］ ，肝癌［3］ ，肝内转移癌［4，5］ ，近期程庆书等［6］ 报道应用射频消融技术治疗肺内肿瘤，赵正源等［7］ 报道射频消融治疗肺内转移瘤，取得良好效果.本实验探讨射频消融兔肺内VX2肿瘤诱导细胞凋亡情况.现介绍如下.
1 材料和方法
1.1 材料 VX2肿瘤细胞是一种可移植的兔鳞状细胞癌株，该细胞株由第四军医大学病理学教研室提供.射频机及电极:RF2000型射频机及10尖锚状电极，美国Radiotherapeutic公司生产.CT机:EXEL2400elect型CT机，以色列Elscint Ltd.公司生产.光学显微镜:日本Olympus公司生产.透射电镜:JEM-2000EX型透射电镜，日本JEOL公司生产.荧光显微镜:日本Olympus公司生产.
1.2 方法
1.2.1 兔肺肿瘤模型的制作 将冰冻VX2细胞悬液常规细胞培养法复苏后，取1mL（107 ・mL-1 ）接种于1兔后腿外侧肌肉内，制成荷瘤种兔，2wk后可扪及一实质性包块.无菌条件下切取肿瘤，取肿瘤边缘生长旺盛的鱼肉样组织，剪切成泥，先过20目筛，取筛下部分，再过30目筛，并用1640培养液冲洗，以除去单个细胞和过小的组织块，取30目筛上部分，以1640培养液制成组织块悬液，在X线引导下注入兔右肺下叶内，3d后CT扫描观察肿瘤生长情况，待发现肿瘤生长至直径大于10mm后即可用于射频治疗.本实验采用上述方法在20只新西兰白兔体内建立肺内VX2肿瘤移植模型，随机将这20只新西兰白兔分为治疗组12只用于射频消融，8只用作对照进行假性治疗，只置入电极，不予射频治疗.
1.2.2 射频治疗过程 RF2000型射频机采用双负极输入，可伸缩的10针锚状电极输出，电极展开最大直径为35mm，输出频率为450MHz，最大输出功率100W，可调节输出功率，可控治疗时间，可测定阻抗，并将阻抗和治疗时间输入计算机绘制成图.治疗前将兔右胸壁、腹部及背部脱毛，以速眠新（846）0.8mL・kg-1 im麻醉，仰卧固定于托板上，放置负极板于腹部和背部脱毛区，右胸壁常规消毒，铺无菌手术巾.CT扫描确定肿瘤部位及穿刺部位、方向、深度，置入电极，再CT扫描，确定电极位于肿瘤区，展开电极直径达18～20mm，开启射频机，起始输出功率为30W开始治疗，每分钟升高10W，最高输出功率达60W，当阻抗达999Ω时自动停机，退出电极，CT扫描观察肿瘤阴影变化及有无血气胸发生，术后常规饲养，并给予氨苄青霉素0.25g im，1・d-1 .
1.2.3 标本采集 治疗结束24h，空气栓塞法处死新西兰白兔，治疗组取消融区中心及消融区边缘组织为凋亡检测标本，对照组取肿瘤中心组织为凋亡检测标本，常规制片待检.
1.2.4 凋亡细胞检测 采用Clontech公司生产的ApoAlert○R DNA Fragmentation Assay Kit-TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒对上述标本进行检测，严格按照试剂盒说明进行操作，FITC荧光标记，PI复染，荧光显微镜检查，细胞核内出现黄绿色荧光为阳性细胞，随机计数10个高倍视野中凋亡细胞数目为凋亡细胞指数.
统计学方法:t检验.
2 结果
2.1 射频治疗后肿瘤组织和周围肺组织的病理改变 射频治疗后肿瘤组织呈灰白色、干燥的凝固性坏死，中间破溃，与周围肺组织界限清楚，周围肺组织呈红褐色凝固性坏死，在坏死灶周边为出血带，在出血 带外侧是大片的充血、水肿区;切面上见肿瘤坏死灶、肺组织坏死灶、出血带、水肿区呈年轮样分布.HE染色，见肿瘤组织大片凝固性坏死，细胞结构破坏，仅见组织轮廓，消融灶周围肺组织充血、出血明显，肺泡腔内充满大量渗液，肺泡间隔增宽，消融灶周围肺组织中有大量中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸细胞浸润.透射电镜检查发现大量细胞坏死，细胞内超微结构破坏，可见大量空泡，细胞膜、核膜破坏明显，核溶解、核碎裂明显，仅个别细胞可见残存的张力原纤维，不见桥粒结构，个别细胞内可见核内假性包涵体，于消融的肿瘤周边部分取材的标本中可见较多凋亡细胞和凋亡小体，组织内可见较多分叶核细胞浸润和巨噬细胞浸润，并可见明显的吞噬现象. 2.2 肿瘤组织凋亡细胞指数 采用TUNEL法检测肿瘤组织中凋亡细胞，发现治疗组毁损区边缘部标本中由大量阳性染色细胞（Fig1），而在毁损区中心部标本中亦有较多阳性染色细胞，两者凋亡细胞指数差异非常显著（P&<0.01），而对照组标本中仅发现极少数阳性细胞，其凋亡细胞指数与上述两组标本相比，差异均非常显著（P&<0.01，Tab1）.
图1 射频毁损区边缘部肿瘤组织中的凋亡细胞 略
表1 射频毁损区中央部、边缘部及对照组肿瘤组织凋亡细胞指数 略
4 讨论
VX2肿瘤起源于Shope病毒诱导的兔乳头状瘤衍生的鳞癌［8］ ，是一种可移植的肿瘤细胞株.本实验采用组织块悬液肺内注入法制作兔肺VX2肿瘤模型，方法简单、成功率高、性质稳定、无自发消退现象，为研究肺癌难得的大型动物模型.
细胞凋亡失衡是肿瘤发生发展的重要原因，而诱导肿瘤细胞凋亡已成为治疗恶性肿瘤的一个重要研究方向，细胞凋亡过程估计为12～24h，出现形态改变大约是最后2～3h，而DNA降解为180～200bp片段及寡核苷酸小体也是较晚时才发生［9］ .TUNEL法是利用这些降解的DNA片段进行末端标记，以辨认凋亡细胞，计数凋亡细胞指数是衡量组织中细胞发生凋亡程度的一项重要指标.
射频应用于软组织肿瘤治疗已有多年历史，但采用经皮穿刺射频治疗肺癌刚开始.其原理［10］ 是射频机产生的振荡电流经电极导入组织内，根据电磁场的波动理论，电介质在受外电磁场作用时会产生极化，消耗大量电场能量，这些能量则转化为热;另一方面根据电工学理论，当电流通过组织时会因为欧姆电阻的损耗而产生焦耳热，使周围组织温度升高.高温的细胞毒作用主要是破坏细胞的膜结构，其次是蛋白质和DNA，使细胞损伤.体外细胞培养研究表明细胞在接受低剂量热能时首先诱导凋亡，然后继续接受热能则发生坏死［11］ .我们的实验结果证实在活体内射频高温诱导大量肿瘤细胞凋亡，在高温毁损区边缘肿瘤组织中细胞凋亡程度较毁损区中心肿瘤组织严重，其原因可能是在毁损区中心因高温致肿瘤细胞直接迅速坏死，而在此中心部向周边移行区域温度逐渐过渡到正常体温水平，在此过渡区域内，由于热损伤诱导大量细胞凋亡.通过本实验发现诱导细胞凋亡是射频消融治疗恶性肿瘤的一项重要机制.
参考文献
［1］Rosenthal Dl，Springfield DS，Gebhart MC.Osteoid osteoma:Percutaneous radiofrequency ablation ［J］.Radiology，1995;197（1）:451-454.
［2］Anzai Y，Lufkin R，DeSalles A.Preliminary experience with MR-guided thermal ablation of brain tumors ［J］.AJNR，1995;16（1）:39-48.
［3］Rossi S，Fornari F，Buscarini L.Percutaneous ultrasound-guid-ed radiofrequency electrocautery for the treatment of small hepa-tocellular carcinoma ［J］.J Intervent Radiol，1993;8（1）:97-103.
［4］Solbiati L，Lerace T，Goldberg SN.Percutaneous US-guided RF tissue ablation of liver metastases:Long-term follow up（Abstr）［J］.Radiology，1995;197（p）:199.
［5］Livraghi T，Goldberg SN，Lazzaroni S.Saline-enhanced RF tis-sue ablation in the treatment of liver metastases（Abstr）［J］.Radiology，1995;197（p）:140.
［6］Cheng QS，Zhao ZY，Liu K.Percutaneous radiofrequency hy-perthermia for cancer by the using of computer tomgraphy-guid-ed anchor-shaped electrode report of105case ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（11）:1399-1401.
［7］Zhao ZY，Cheng QS，Wang YJ.Percutaneous anchor-shaped electrode radiofrequency hyperthermia ablation of lung metas-tases ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（11）:1396-1398.
［8］Luo SR，Wang YX，Yang L.The establish and application of animal of rabbit VX2hepatocellular carcinoma ［J］.Zhonghua Fangshe Zhongliuxue Zazhi（Chin J Radio Oncol），1992;1（1）:21.
［9］ Tina Rich，Rachel L.Defying death after DNA damage ［Review］［J］.Nature，2000;407（12）777-788.
［10］Lin SY，Li RY ［A］.Morden hyperthermia of tumor ［M］.Tian-jin:Tianjin Kexue Jishu Chubanshe（Tianjin Publishing House of Science&&Technology），1997:120-121.
［11］Honma T.Characteristics of hyperthermia-induced apoptotic cell death ［Review］ ［J］.Nippon-Rinsho，1996Jul;54（7）:1949-1954.转贴于