作者：刘亚莉 迟素敏 朱运龙 薛采芳
【关键词】 ，雌二醇
关键词: 雌二醇;癌，鳞状细胞;舌肿瘤;细胞分裂
摘 要:目的 观察雌二醇（estradiol，E2 ）对培养的人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系细胞增殖的影响. 方法 将E2 作用于体外培养的人舌鳞癌细胞，采用四唑盐（MTT）比色试验及3 H-TdR掺入试验，测定MTT反应A490nm 值和3 H-TdR掺入量，并用流式细胞仪测定细胞周期. 结果 不同浓度的E2 （10-8 ～10-6 mol・L-1 ）可明显增加人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的增殖，MTT的A490nm 值变化率分别为（107.5±2.6）%，（113.1±3.1）%和（120.0±3.7）%（P&<0.01），cpm值的变化率分别为（108.2±4.0）%，（116.7±4.2）%和（124.8±3.2）%（P&<0.01），并存在着剂量效应.10-6 mol・L-1 的β-E2 能使人舌鳞癌细胞进入S期和G2期的细胞比例从16.3%和7.2%上升到21.1%和16.6%，而使处于G1期的细胞比例从76.5%下降到62.3%（P&<0.01），从而细胞的DNA合成增加，促进其增殖.E2 对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的促增殖作用可被Tamoxifen阻断. 结论 E2 在体外能明显促进培养的人舌鳞癌细胞的增殖.
Keywords:estradiol;carcinoma，squamous cell;tongue neo-plasms;cell pision
Abstract:AIM To study the influence of estradiol on the proliferation，DNA synthesis and cell cycle of cultured human tongue squamous cell carcinoma Tca8113cells.METHODS MTT method，3 H-TdR incorporation and cell cycle analysis were used to examine the changes in proliferation and DNA synthesis of the human tongue squamous cell carcinoma Tca8113cells.RESULTS In a dose dependent manner，estradiol at different concentration（10-8 mol・L-1 ，10-7 mol・L-1 ，10-6 mol・L-1 ）could significantly increase the proliferation of human tongue squamous cell cancer Tca8113cells cultured in vitro.The change rates of A490nm value were（107.5±2.6）%，（113.1±3.1）%and（120±3.7）%respec-tively（P&<0.01），and the change rates of cpm value were（108.2±4）%，（116.7±4.2）%and（124.8±3.2）%respec-tively（P&<0.01）.Estrodiol could increase the proportion of cells in S phase and G2phase from16.3%and7.2%up to21.1%and16.6%（P&<0.01），and reduce the proportion of cells in G1 phase from76.5%to62.3%（P&<0.01）.The ef-fects of estradiol on the proliferation of cultured human tongue squamous cell cancer Tca8113cells could be inhibited by tamoxifen.CONCLUSION Estradiol promotes the pro-liferation，DNA synthesis and cell cycle of cultured human tongue squamous cell cancer Tca8113cells，and the promo-tion effect might be mediated by estrogen receptor.
0 引言
据统计资料分析，口腔颌面部恶性肿瘤占全身恶性肿瘤的8.2%，而舌部又是口腔癌的高发部位.口腔颌面部肿瘤的致病因素与发病条件至今被认为是一个较复杂的问题［1］ .目前对口腔颌面部肿瘤病因的认识大多都接受“癌瘤病因综合作用”的概念，其中环境因素有化学、物理及生物等致病因素，机体内在的因素有免疫［2-3］ 、激素、代谢及遗传［4］ 等.近年的资料［5］ 表明，女性罹患舌癌者有上升的趋势，且女性患舌癌的预后相对比男性差，其真正发病因素尚待进一步研究.我们以人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系为研究对象，探讨雌二醇（estradiol，E2 ）对培养的人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系细胞增殖的影响.
1 材料和方法
1.1 材料 胰蛋白酶，β-雌二醇（β-E2 ），Tamoxifen，MTT（噻唑蓝）等均购自美国Sigma公司;DMEM培养基购自美国Gibco公司;新生牛血清为杭州四季青生物制品公司产品;3 H-TdR购自上海原子能科学研究院;人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系为第四军医大学西京医院皮肤科惠赠.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞在含100mL・L-1 小牛血清的DMEM培养液中常规培养，传代时用2.5g・L-1 胰蛋白酶消化，1000r・min-1 离心5min，弃上清，加入含100mL・L-1 小牛血清的DMEM培养液，轻轻吹起细胞，调整细胞密度，以5×108 ・L-1 接种于96孔板，每孔100μL，移入CO2 孵箱中，在37℃，50mL・L-1 CO2 及饱和湿度条件下培养，24h换液.
1.2.2 MTT试验 鳞癌细胞培养至第3日换无血清DMEM培养液，24h后换含不同浓度的β-E2 （10-8 ，10-7 和10-6 mol・L-1 ）和β-E2 （10-6 mol・L-1 ）加Tamoxifen（10-6 mol・L-1 ）的无血清培养液，对照为无血清DMEM培养液.孵育24h，每孔加入MTT溶液（5g・L-1 MTT的PBS）20μL，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，振荡10min，在酶联免疫检测仪上测定各孔A490nm 值，计算变化率.变化率（%）=（试验组A490nm /对照组A490nm ）×100%.
1.2.3 3 H-TdR掺入试验 鳞癌细胞培养至第3日换无血清DMEM培养液，24h后换含不同浓度的β-E2 （10-8 ，10-7 和10-6 mol・L-1 ）和β-E2 （10-6 mol・L-1 ）加Tamoxifen（10-6 mol・L-1 ）的无血清培养液，对照为无血清DMEM培养液.24h后，每孔加入3 H-TdR（1.85MBq・L-1 ）继续孵育12h，终止反应.经ZT-2型微量多头细胞收集器收集细胞于9999型玻璃纤维膜上，红外线烘干后置入闪烁瓶中，加入PPO/POPOP/二甲苯闪烁液，用液闪计数器进行3 H-TdR掺入率的测定，记录cpm值，计算变化率.变化率（%）=（试验组cpm/对照组cpm）×100%.
1.2.4 流式细胞仪（FCM）测定细胞周期 细胞悬液密度同上，取2mL细胞悬液接种于25mL培养瓶中，培养条件同上，培养至第3日换无血清DMEM培养液，24h后换β-E2 （10-6 mol・L-1 ）和β-E2 （10-6 mol・L-1 ）加Tamoxifen（10-6 mol・L-1 ）的无血清培养液，对照为无血清DMEM培养液.继续孵育24 h后，用2.5g・L-1 胰蛋白酶和0.2g・L-1 EDTA联合消化，离心，收集细胞，PBS清洗2次，1000r・min-1 离心，弃上清，加PBS1mL，轻轻吹匀细胞，加无水乙醇2mL固定.用FCM EPICS ProfiLeⅡ型测定细胞周期.
统计学分析:所有数据均以x ±s表示，各组间均数比较用t检验处理.
2 结果
2.1 E2 对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖和DNA合成的影响 人舌鳞状细胞癌细胞为均一的多角形上皮样细胞，镶嵌状排列，少数为圆形，多核巨细胞和巨核细胞;细胞核大，类圆形，核仁清晰，大小不一;胞质色淡，空泡多，呈泡沫状.细胞多成堆生长，表现为“接触抑制”消失.至第4日加药，24h后进行MTT和3 H-TdR的测定.结果表明，以对照组的A490nm 和cpm作为100%，不同浓度的β-E2 （10-8 ，10-7 和10-6 mol・L-1 ）对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞的增殖有促进作用，并存在剂量效应，MTT的A490nm 变化率分别为（107.5±2.6）%，（113.1±3.1）%和（120.0±3.7）%（P&<0.01），cpm值变化率分别为（108.2±4.0）%，（116.7±4.2）%和（124.8±3.2）%（P&<0.01，Fig1）.
2.2 雌二醇对人舌鳞癌细胞增殖周期的影响 人舌鳞状细胞癌细胞在10-6 mol・L-1 β-E2 的条件下培养24h后作流式细胞仪分析，结果发现G1期的细胞比例从对照组的76.5%下降为62.3%，S期的细胞比例从对照组的16.3%上升为21.1%，G2期的细胞比例从对照组的7.2%上升为16.6%.表明10-6 mol・L-1 的β-E2 能增加人舌鳞癌细胞进入S和G2期的细胞比例，而使处于G1期的细胞比例下降.与此同时，在β-E2 （10-6 mol・L
-1 ）加入Tamoxifen（10-6 mol・L-1 ）的条件下培养24h后的细胞比例与对照组相比无明显差异（P&>0.05，Fig2）.
图2 略
3 讨论
Bithner，Huggins，Furth以及其他研究者早期的研究表明性激素能引起或至少可以促进肿瘤的生长［6］ .例如:患乳腺瘤和宫颈癌后，发生口腔癌和口咽癌的机会大大增加.已有的研究亦已经证实了性激素（尤其是E2 ）和阴道癌、卵巢癌、喉癌以及肝细胞癌的相关性［7］ .
目前，雌激素受体和孕激素受体不仅对乳腺癌、子宫内膜癌和前列腺癌的内分泌治疗有着重要的价值，而且对预测乳腺癌的临床反应性也具有重要的意义.已有文献报道在食管癌［8］ 、肺癌［9］ 、胆囊肿瘤和上颌窦鳞癌［10］ 、喉癌、宫颈癌［11］ 及某些胃癌［6］ 中已检测到雌激素受体.我们的实验结果发现，E2 可以促进体外培养的人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞系细胞的增殖代谢，且这种促进作用可被雌激素受体阻断剂 Tamoxifen所阻断.MTT实验和3 H-TdR掺入实验的结果均可表明人舌鳞状癌细胞的增殖代谢得到了明显的促进.在E2 作用后，人舌鳞状癌细胞处于DNA合成前期（G1期）的细胞下降至62.3%，而处于DNA合成期（S期）以及DNA合成后期（G2期）的细胞上升至37.7%，明显高于对照组，提示E2 能增加人舌鳞癌细胞进入S期和G2期的细胞比例，因而细胞的DNA合成增加，促进其细胞的增殖.因此，E2 对人舌鳞癌细胞的增殖分化有显著的调控作用.同时，我们初期的实验结果亦发现舌鳞癌细胞上有ER的表达，这两方面的结果均提示E2 及其受体在舌鳞癌的产生、发展中起着一定的作用.对此调控作用机制的进一步深入研究将有助于了解人舌鳞癌的发生和发展机制，并对今后人舌鳞癌的临床内分泌治疗这一可行性设想提供参考.
参考文献
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