关于大鼠延髓背角浅层内CGRP阳性终末与GABA及甘氨酸能神经元的突触联系

【关键词】 甘氨酸
　　关键词: GABA;甘氨酸;延髓;免疫电镜;大鼠
　　摘 要:目的 观察大鼠延髓背角（MDH，三叉神经脊束核尾侧亚核）浅层（Ⅰ，Ⅱ层）内降钙素基因相关肽（CGRP）阳性终末与γ-氨基丁酸（GABA）能和甘氨酸（Gly）能神经元的突触联系. 方法 包埋前GABA或Gly免疫组织化学染色方法结合包埋前CGRP免疫金标记电镜技术. 结果 GABA或Gly阳性产物广泛分布于神经元胞体、轴突和树突内，CGRP阳性标记主要见于无髓和薄髓轴突内.约53%和51%的CGRP阳性轴突终末分别与GABA和Gly阳性神经元的胞体或树突形成非对称性突触，其中的多数为轴-树突触，轴-体突触较少. 结论 含CGRP的初级传入纤维直接与MDH浅层内的GABA能及Gly能抑制性中间神经元形成突触联系.
　　
　　Keywords:GABA;glycine;medulla oblongata;microscope，immunoelectron;rats
　　
　　Abstract:AIM To investigate the synaptic connections be-tween calcitonin gene-related peptide-immunoreactive（CGRP-ir）terminals andγ-aminobutyric acid（GABA）-and glycine（Gly）-ir neurons in the superficial layers（laminae I and II）of rat medullary dorsal horn（MDH）.METHODS Pre-embedding immunohistochemical detection of GABA or Gly，combined with pre-embedding gold marking technique，was used to identify CGRP-immunoreactivity.RESULTS Densely stained GABA-and Gly-ir neuronal cell bodies as well as axonal and dendritic profiles were observed in laminaeⅠandⅡof the MDH，while CGRP-immunoreactivity was found distributed mainly within thin myelinated and unmyeli-nated axons and their terminals.About53%of CGRP-ir ter-minals made asymmetric synapses with GABA-ir cell bodies and dendrites and so did51%of CGRP-ir terminals with Gly-ir cell bodies and dendrites，the majority of which were axon-dendritic synapses and the minority were axo-somatic synaps┐es.CONCLUSION CGRP-containing primary afferent fibers make direct synaptic connections with GABAergic and glycinergic inhibitory interneurons in laminaeⅠandⅡof the rat MDH.
　　
　　0 引言
　　
　　延髓背角（MDH，三叉神经脊束核尾侧亚核）的浅层（Ⅰ，Ⅱ层）由投射神经元和中间神经元构成，主要接受传递面口部伤害性信息的初级传入纤维［1，2］ .MDH浅层内有γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸（Gly）能的抑制性中间神经元，它们在外周伤害性信息向中枢传递的过程中，发挥着重要的调控作用.P物质（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）是三叉神经节发出的无髓或薄髓初级传入纤维的神经活性物质，主要参与伤害性信息向MDH的传递［3，4］ .我们以往的研究观察到含SP的初级传入终末与GABA和Gly能神经元形成突触联系［5］ .本研究用包埋前GABA或Gly免疫组化染色方法结合包埋前CGRP免疫金标记的电镜技术，对MDH浅层内CGRP阳性终末与GABA及Gly能抑制性中间神经元的突触联系进行了观察.
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 ①实验动物SD大鼠8只，体质量200～250g，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供;②实验仪器Philips CM100电子显微镜.
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1 取材 在ip戊巴比妥钠（100mg・kg-1 ）的深麻醉状态下开胸，经左心室插管至升主动脉，先用100mL生理盐水冲洗血液，再灌注500mL含40g・L-1 多聚甲醛、2g・L-1 苦味酸和0.5g・L-1 戊二醛的0.1mol・L-1 磷酸缓冲液（PB;pH7.3），持续1.5～2.0h.灌注完毕立即取脑并置于上述新鲜固定液中后固定4～6h.振动切片机冠状切脑干，片厚40μm，切片分2组收集.经冷冻保护后，用液氮对切片进行冻融，以增强抗体穿透细胞膜的能力.再将切片置入含0.2L・L-1 正常羊血清的0.05mol・L-1 Tris盐酸缓冲盐（TBS）溶液中孵育0.5h，以阻断非特异性免疫反应.
　　
　　1.2.2 免疫细胞化学染色 切片经0.05mol・L-1 磷酸缓冲盐溶液（PBS;pH7.4）漂洗后，用ABC法对第1组切片在室温下进行GABA/CGRP的免疫细胞化学染色，步骤如下:将切片在豚鼠抗GABA血清（1∶1000;Chemicon）和兔抗CGRP血清（1∶1000;Incstar）的混合液中孵育24h;用结合有生物素的驴抗豚鼠IgG（Jackson）和结合有1.4nm免疫金颗粒（1∶100;Nanoprobes）的羊抗兔IgG的混合液孵育16～18h.对第2组切片进行Gly/CGRP的免疫细胞化学染色，步骤如下:将切片在兔抗Gly血清（1∶1000;Chemicon）和小鼠抗CGRP单克隆抗体（1∶200;Chemicon）的混合液中孵育24h;用结合有生物素的驴抗兔IgG（1∶100，Jackson）和结合有1.0nm的免疫金颗粒（1∶100;Aurion）的羊抗小鼠IgG的混合液孵育16～18h.在上述各步骤之间，均用0.05mol・L-1 的TBS清洗.对抗体和复合物稀释时都用含0.2L・L-1 正常驴血清的0.05mol・L-1 的TBS.此后，对切片进行下列处理:①10g・L-1 戊二醛后固定10min;②HQ Silver Kit（Nanoprobes）进行银加强8～14min;③ABC Kit（Vector）孵育2h.切片在含0.2g・L-1 二氨基联苯胺和0.03mL・L-1 双氧水的0.05mol・L-1 Tris-HCl缓冲液（pH7.6）内呈色10～20min.上述各步骤之间均用PBS洗片3次，每次10min.将免疫组化染色后的切片置入10g・L-1 锇酸溶液固定1h，在含700mL・L-1 乙醇的饱和醋酸铀溶液中过夜，梯度乙醇及环氧丙烷脱水，Durcupan（Fluca）平板包埋、聚合.在解剖显微镜下取出延髓背角浅层，粘接在环 氧树脂柱上，超薄切片，将切片裱于铜网.枸橼酸铅染色，电镜观察、摄片.
　　
　　1.2.3 对照实验 在省略一抗的条件下，其余染色步骤同上，进行了对照实验，电镜下未见GABA或Gly阳性反应产物及CGRP免疫金标记.
　　
　　2 结果
　　
　　在电镜下，GABA和Gly阳性反应产物广泛分布于MDH浅层神经元的胞体、树突、轴突及其终末内（Fig1，2）.在阳性神经元胞体内，GABA和Gly阳性反应产物见于胞膜下以及胞内的线粒体、内质网等膜性结构的表面;在树突内，阳性反应产物则见于树突膜下和树突内的细胞器表面及其内部;在轴突内，阳性反应产物主要分布于突触小泡膜下.CGRP免疫金标记颗粒分布于薄髓和无髓的轴突终末内，主要见于颗粒小泡中（Fig1，2）.CGRP阳性终末与GABA或Gly阳性神经元的胞体及树突形成非对称性突触联系.在GABA和CGRP染色的标本上观察到的95个CGRP阳性终末中，有53%（50个）与GABA能神经元形成突触，其中42个（84%）为轴-树突触（Fig1），8个（16%）为轴-体突触;在Gly和CGRP染色的标本中，观察到69个CGRP阳性终末，有51%（35个）与Gly能神经元形成突触，其中30个（86%）为轴-树突触（Fig2），5个（14%）为轴-体突触.在CGRP阳性轴突终末内，有大量的多形性突触小泡.其中，圆形清亮小泡最多，颗粒小泡次之，偶见扁平小泡（Fig1，2）.
　　
　　此外，在电镜下尚可见含大量扁平小泡的GA-BA能轴突终末与GABA能树突形成对称性突触联系（Fig1）.
　　
　　3 讨论
　　
　　GABA和Gly是重要的抑制性神经递质，在MDH内，主要存在于抑制性中间神经元.在中枢内源性镇痛系统中，GABA可能通过激活GABAB 受体，参与对伤害性信息的调控［6，7］ .在MDH浅层，GABA能和Gly能抑制性中间神经元通过对初级传入纤维、兴奋性中间神经元和投射神经元的抑制效应，对外周伤害性信息向中枢的传递进行调制.MDH浅层内分布着大量的GABA和Gly能神经元的胞体和突起，在GABA阳性神经元中，约有一半也呈Gly阳性，而Gly阳性神经元中，大多数都同时呈GABA阳性［5］ .在MDH浅层内，GABA能和Gly能神经元的胞体和树突直接与含SP的初级传入纤维的终末形成突触联系，提示它们直接接受外周伤害性传入信息［5］ ;而GABA能和Gly能的轴突则与投射神经元形成对称性（抑制性）突触，可能抑制面口部伤害性信息向上位中枢的传递［8］ .此外，我们以往的研究表明，内源性镇痛系统的下行投射纤维终末在MDH浅层内密集分布［9-11］ ，也参与了对伤害性信息传递的抑制［12］ . 　　图1 － 图2 略
　　
　　因为MDH既不接受来自中枢的CGRP能投射，也没有CGRP阳性神经元，所以，MDH内的CGRP阳性终末均来自于初级传入纤维.在MDH内，CGRP既能增强兴奋性神经递质谷氨酸和SP的释放，也能直接兴奋部分延髓背角Ⅱ层的神经元［3］ .此外，尚有研究表明鞘内注射CGRP抗血清后，大鼠足底注射弗氏佐剂或角叉菜胶引起的热痛敏、机械性痛敏现象消失［13］ .上述结果表明，CGRP在MDH的Ⅰ，Ⅱ层内发挥兴奋性作用，促进伤害性信息向中枢的传递.我们对MDHⅠ，Ⅱ层内GABA阳性及Gly阳性神经元与CGRP阳性终末的突触联系进行了观察，见到GABA阳性及Gly阳性神经元的胞体和树突位于CGRP阳性终末的突触后，两者之间主要形成非对称性（兴奋性）突触，但未见到GABA或Gly阳性终末与CGRP阳性初级传入纤维之间的突触联系.上述结果提示外周伤害性刺激可能促进CGRP的释放，经由兴奋性突触将伤害性信息传递给GA-BA能及Gly能神经元，激活MDH浅层中的抑制性环路，对伤害性刺激进行调制.此外，我们在电镜下还观察到突触前和突触后均为GABA阳性的轴-树突触（Fig1）.此类突触可能通过抑制GABA能中间神经元，对投射神经元发挥脱抑制（disinhibitior）作用，使投射神经元的兴奋性增强，进而促进伤害性信息的传递.
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