关键词: α-晶体蛋白;分子伴侣;次声
摘 要:目的 探讨次声对α-晶体蛋白分子伴侣活性的影响. 方法 采用Sephacryl S-300凝胶柱分离牛α-晶体蛋白.应用次声压力舱，以16Hz，130dB次声作用αL -晶体蛋白溶液（g・L-1 ），每天作用2h，连续16d.分光光度计检测360nm时αL -晶体蛋白对加热诱导过氧化氢酶（CAT）和βL -晶体蛋白凝聚的保护作用.孵育60min，以αL -晶体蛋白占对照靶蛋白光散射值的百分比表示α-晶体蛋白分子伴侣功能. 结果 与对照蛋白比较，α-晶体蛋白具有特异性保护CAT和βL -晶体蛋白热凝聚的作用.次声作用第16日，对照组αL -晶体蛋白保护βL -晶体蛋白热凝聚的作用为（92.0±3.1）%，次声组为（81.2±5.4）%，降低约10.8%（P&<0.01）;对照组αL -晶体蛋白保护CAT热凝聚的作用为（73.8±5.1）%，次声组为（61.8±9.1）%，降低约12.0%（P&<0.01）. 结论 次声可影响α-晶体蛋白的分子伴侣活性.
Keywords:α-crystallin;molecular chaperone;infrasound
Abstract:AIM To investigate the effect of infrasound on molecular chaperone activity ofα-crystallin.METHODS Theα-crystallin of bovine lens were separated by chromatog-raphy on Sephacryl S-300HR.The solutions ofαL -crystallin（mg・ml-1 ）from nucleus were exposed to infrasound of16Hz with the intensity of160dB（2hours per day for16con-secutive days）.The protective effects ofαL -crystallin on ther-mal aggregation of catalase andβL -crystallin were measured spectrophotometrically at360nm.The chaperone activity ofα-crystallin was represented as the percentage of protection byαL -crystallin of the scattering produced by the target pro-tein control after60min incubation.RESULTS αL -Crys-tallin specifically protected catalase andβL -crystallin against thermal aggregation compared with control proteins.At16days after exposure to infrasound，protection catalase against thermal aggregation in infrasound group（73.8±5.1%）was decreased by12%comparing with control group（61.8±9.1%）（P&<0.01），and protectionβL -crystallin against ther-mal aggregation in infrasound group（81.2±5.4%）was by10.8%comparing with control group（92.0±3.1%）（P&<0.01）.CONCLUSION These results suggest that infra-sound can influence the molecular chaperone activity ofα-crystallin.
0 引言
晶体蛋白（crystallin）约占干燥晶状体质量的90%以上，而α-晶体蛋白是晶状体中主要的晶体结构蛋白.它除了维持晶状体结构完整，保持其屈光性外，还具有分子伴侣（molecular chaperone）活性，可抑制晶状体代谢酶和晶体蛋白对各种变性剂包括加热、紫外线辐射和化学性修饰造成的蛋白质非特异性的凝聚和失活，这在维持晶状体透明性中起到了重要的作用.同时，α-晶体蛋白并非是晶状体特异性蛋白质，它还存在于机体许多组织中，αB-晶体蛋白表达的增强见于神经系统退行性疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）以及应激反应［1］ .次声（infra-sound）为一种低频率（≤20Hz）的声波，具有独特的物理性质.它诱发机体组织和器官发生共振，并通过复杂的分子机制而影响各系统的功能［2-6］ ，可导致神经系统和眼组织的损害［7-9］ .但适量的使用次声，还可治疗近视［10］ .本研究采用α-晶体蛋白对重要的抗氧化酶-过氧化氢酶（catalase，CAT）和βL -晶体蛋白热凝聚的保护作用，作为分子伴侣的观察指标，观察次声（16Hz，130dB）是否影响α-晶体蛋白的伴侣活性，为次声作用分子机制的研究提供一定的实验依据.
1 材料和方法
1.1 材料 牛肝脏CAT（EC1.11.1.6），鸡蛋溶菌酶、牛血清白蛋白等为Sigma公司产品，凝胶色谱柱Sephacryl S-300HR为Pharmica公司产品.牛晶状体由西安协和食品加工公司提供.
1.2 方法
1.2.1 α-晶体蛋白分离和纯化［11］ 4只新鲜透明牛晶状体，去囊膜，分离皮质和核，将晶状体核匀浆（0.05mol・L-1 磷酸钠缓冲液，0.2mol・L-1 KCl，1mmol・L-1 EDTA，pH6.7），混合物22440g离心40min.采用凝胶色谱法分离晶状体结构蛋白（凝胶柱100cm×1.6cm，流速18mL・h-1 ），根据色谱图分别收集αL 和βL -晶体蛋白，透析24h，采用FTS System真空冷冻干燥仪（美国）低温冷冻干燥，-20℃储存备用.采用Bio-Rad蛋白电泳仪，参照Derham等的SDS-PAGE方法检测α-晶体蛋白的纯度.
1.2.2 次声作用 将牛晶状体核αL -晶体蛋白溶解于50mmol・L-1 磷酸钠缓冲溶液（pH7.0），将αL -晶体蛋白磷酸钠缓冲溶液（1g・L
-1 ）分装于消毒玻璃瓶中，置于第四军医大学研制的电子激励式次声压力舱中，采用16Hz和130dB的声压，室温下作用2h・d-1 ，持续16d，并分别于1，3，5，7，10和16d进行热凝聚实验.
1.2.3 热凝聚实验 次声组和对照组牛晶状体核αL -晶体蛋白分别与CAT（250mg・L-1 ）和牛皮质βL -晶体蛋白（250mg・L-1 ）按分子质量比（W/W）1∶2.5溶解于50mmol・L-1 磷酸钠缓冲溶液（pH7.0），将混合液通过0.2μm微孔过滤器，按1mL分装于小玻璃瓶，每组6份样品.将牛透明晶状体核βL -晶体蛋白、牛血清白蛋白、溶菌酶设为对照蛋白.60℃水孵箱加热，孵育60min，使用分光光度计于360nm检测混合液的光散射值.以αL -晶体蛋白占对照靶蛋白光散射值的百分比表示α-晶体蛋白分子伴侣功能.
统计学处理:本研究数据为x ±s，结果采用SPSS软件中t检验进行统计分析.
2 结果
次声可降低α-晶体蛋白保护加热诱导CAT和βL -晶体蛋白凝聚的作用（Fig1）.次声作用第1～10日，未显著影响α-晶体蛋白保护加热诱导CAT凝聚的作用.第16日时，对照组α-晶体蛋白保护CAT热凝聚的作用为（73.8±5.1）%，次声组为（61.8±9.1）%，降低约12.0%（P&<0.01）.第10日时，次声组α-晶体蛋白保护βL -晶体蛋白热凝聚的作用降低约4.2%（P&<0.05）;第16日时，对照组α-晶体蛋白保护βL -晶体蛋白热凝聚的作用为（92.0±3.1）%，次声组为（81.2±5.4）%，降低约10.8%（P&<0.01）.次声对α-晶体蛋白保护加热诱导CAT凝聚作用的影响比对βL -晶体蛋白热凝聚的作用明显. 图1 略
对照蛋白（牛透明晶状体核βL -晶体蛋白和溶菌酶）均未表现出任何保护作用，而牛血清白蛋白表现出微弱的保护效应，但无统计学意义.
3 讨论
α-晶体蛋白是晶状体中重要的组成蛋白之一，约占晶体结构蛋白的40%，Mr 7～8×105 ，由35～40个由αA和αB亚基组成，每个亚基Mr 为2×104 ，其57%为同源［1-2］ .在不同种类的晶状体和其他学者的报道中，这些数字会有不同.直至20世纪80年代中期，α-晶体蛋白仍被认为是晶状体的特异性蛋白质.Bhat等［12］ 首次证实αB-晶体蛋白存在于心脏、骨骼肌、皮肤、脑、脊髓和肺.并于大鼠心脏中得到αB-晶体蛋白的cDNA克隆.Kato采用敏感的抗体进行免疫分析发现大鼠脾脏和甲状腺含有高浓度的αA-晶体蛋白，至此α-晶体蛋白不再被认为是晶状体的特异性蛋白质.在一些神经退行性疾病如阿尔茨海默病、皮克病和克罗茨费尔特-雅各布病等，α-晶体蛋白高表达，以保护神经细胞的进一步损害.翻译后修饰（PTM）可造成蛋白质结构的改变，进一步导致酶失活和蛋白质的凝聚，形成白内障和阿尔茨海默病大脑的淀粉样变性等［1，2］ .
α-晶体蛋白具有分子伴侣特征，可抑制其他晶体蛋白的热凝聚和保护酶的化学性失活［1］ .由于α-晶体蛋白的Ⅲ和Ⅳ级结构受到方法学和其结构特殊性的影响，其分子伴侣作用的确切机制还不清楚.目前研究认为α-晶体蛋白是四价聚合体，为β-片层结构，2个环形的α-亚基互相连接，具有较大的中央空洞，在空洞的内或外表面，有揉曲性的C-末端残基可与靶蛋白结合，保护蛋白质的凝聚和酶的失活.
次声主要是通过生物共振原理，对自身振动频率接近或符合次声压力场振动频率的组织和器官的功能产生影响.已有报道，次声可影响神经系统、听觉系统、免疫系统、肝脏、肺脏、心脏、眼等组织和细胞的功能.同时可造成细胞膜通透性的改变和重要代谢酶的失活［13］ .我们的结果表明，16Hz，130dB的次声连续作用牛α-晶体蛋白16d，可降低其保护CAT和βL -晶体蛋白热凝聚的作用.提示这种次声强度对α-晶体蛋白的分子伴侣功能有明显的抑制作用，并表现为时间依赖效应.这为次声在眼部的安全应用提供了参考.同时由于α-晶体蛋白的多器官表达，可能与次声造成的多器官功能损害机制有关.我们的研究首次报道了次声对离体蛋白质结构功能的影响，其作用机制尚待进一步研究.
在生理状态下，α-晶体蛋白发挥其伴侣活性，保护着其他蛋白质的化学性修饰，从而维持晶体的透明性.当α-晶体蛋白伴侣活性受到除包括氧化损伤、紫外线照射和糖基化等化学性修饰的严重影响外，较长期一定强度的次声作用也可造成这种保护作用的丧失，进而造成晶状体代谢酶对各种损伤的易感性增加，导致晶状体代谢障碍，这有可能是白内障发病的因素之一.进一步研究不同强度的次声对离体或活体α-晶体蛋白伴侣功能的影响，将有助于揭示次声 作用的分子机制.
参考文献
［1］Harding JJ.Biochemistry of the eye ［M］.London:Chapman&&Hall.1997:94-134.
［2］Yuan H，Chen JZ，Li LE.Expression and distribution of heat shock protein70in the brain of the rat exposed to infrasound ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（6）:606-609.
［3］Fei Z，Zhang X，Wang XF.The changes and significance of blood-brain barrier permeability after infrasound damage in rats ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（8）:678-680.
［4］Han LF，Xia HS，Chen JZ.The expression of c-fos and CRF mRNA in hypothalamus of rats after infrasound exposure ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（1）:1-3
［5］Huang WJ，Ia KY，Hang P.HSP70expression in hypothalamus of rats exposed to infrasound ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（2）:162-163
［6］Fu GY，Chen JZ，Jia KY.Changes of glutamate in brain of rats exposed to infrasound ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（4）:288-290
［7］Pawlaczyk-Luszczynsks M.The influence and sources of infra-sound:Review of literature ［J］.Med Pr，1998;49（5）:489-492.
［8］Arabadzhi VI，Infrasound and biorhythms of the human brain ［J］.Biofizika，1992;37（1）:150-151.
［9］Sidorenko EI，Zelikman MKh，Kaplina AV.Changes in eye tis-sues exposed to local action of infrasound ［J］.Oftalmol Zh，1988;2:109-111.
［10］Sidorenko EI.Experience of clinical use infrasound pneumomas-sage in the treatment of progressive myopia in school children ［J］.Vestn Oftalmol，1997;113（3）:18-20.
［11］Derham BK，Harding JJ.Effect of aging on the chaperone-like function of human aα-crystallin assessed by three methods ［J］.Biochem J，1997;328（3）:763-768.
［12］Bhat SP，Nagineni CN.αB subunit of lens specific proteinα-crystallin is present in other ocular and non-ocular tissues ［J］.Biochem Biophys Res Commun，1989;158:319-325.
［13］Svidovyi VI，Kolmakov VN，Kuleba VA.Change in the perme-ability and total ATPase activity of erthrocytes and blood plasma superoxide dismutase activity on exposure to infrasound in vitro ［J］.Gig Sanit，1987;5:78-79.转贴于