关于全反式维甲酸和苯乙酸钠联合对人肝癌细胞的诱导分化作用

【关键词】 肝细胞癌
　　关键词: 维甲酸;苯乙酸钠;肝细胞癌;细胞分化;甲胎蛋白
　　摘 要:目的 探讨全反式维甲酸（ATRA）和苯乙酸钠（Na-PA）两者对人肝癌细胞联合作用. 方法 应用台盼蓝染色、MTT法、流式细胞仪、甲胎蛋白测定等方法检测ATRA和NaPA两者联合对人肝癌细胞的诱导分化作用. 结果 10μmol・L-1 ATRA，2.5mmol・L-1 NaPA及两者联合作用，可抑制人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的生长，使细胞恶性表型向正常转化，其联合作用组7d抑制率达66.5%，并能明显降低甲胎蛋白的分泌量49.2%，使细胞周期G0 /G1 期延长58.7%，S期下降35.8%（P&<0.05），影响DNA合成，最终产生抑制增殖诱导细胞分化的作用. 结论 ATRA，NaPA及两者联合应用均可抑制SMMC-7721细胞生长，诱导细胞分化，ATRA和NaPA联合对人肝癌细胞的诱导分化有协同作用.
　　
　　Keywords:all-trans retinoic acid;phenylacete natrium;hep-atocellular carcinoma;cell differentiation;AFP
　　
　　Abstract:AIM To investigate the effects of all-trans retinoic acid in combination with phenylacete natrium on hu-man hepatocellular carcinoma（HCC）cell line SMMC-7721.METHODS HCC cell line was exposed to all-trans retinoic acid and phenylacete natrium separately and both agents in combining manner respectively.The morphologic and func-tional changes of the cell line were observed with benzo blue，MTT，flow cytometric analysis，image analysis and AFP　measurement.RESULTS Single all-trans retinoic acid or phenylacete natrium could inhibite the proliferation of human HCC cell line（SMMC-7721），which had obvious dose and time effect.After SMMC-7721cells were treated with com-bined treatment of both agents for7d，the suppression rate was about66.5%.The malignant phenotype of the cell line gradually disappeared while characteristics of mature cell were progressively increased.The secretory volume of AFP was reduced by49.2%.The cells at G0 /G1 phase were rela-tively increased by58.7%and synthesis of DNA inhibited by35.8%（P&<0.05）.CONCLUSION The combined use of the two agents can inhibit proliferation and induce differentia-tion in the HCC cell more significantly than any other agent.
　　
　　0 引言
　　
　　肿瘤细胞诱导分化是肿瘤治疗研究的新途径，通过诱导可使其分化为正常或接近正常细胞［1］ .分化诱导剂维甲酸毒副作用较大，长期用药易产生耐药性，因此与其他抗肿瘤药物或诱导剂联合作用，增加疗效降低用药量，日益引起人们的重视.我们探讨了全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）和苯乙酸钠（phenylacete natrium，NaPA）联合作用对人肝癌（HCC）细胞的诱导作用，为寻找高效低毒的分化诱导剂及为探讨诱导剂的联合作用效果及其机制提供实验依据.
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 ATRA购自Sigma公司，NaPA及RP-MI1640购自Haclone公司，100mL・L-1 小牛血清购自杭州四季清公司，MTT及胰酶购自宝泰克公司，甲胎蛋白放免试剂盒由中国原子能科学院提供.人HCC细胞株SMMC-7721第二军医大学建系本室保存.
　　
　　1.2 方法 人HCC细胞株SMMC-7721细胞接种生长在含有100mL・L-1 灭活小牛血清pH7.0～7.2的RPMI1640培养基中，37℃恒温密闭培养.用2.5g・L-1 胰蛋白酶和0.2g・L-1 EDTA的混合液消化单层细胞，制成细胞悬液，计数后备用.ATRA和NaPA分别溶于无水乙醇中，浓度分别为0.45μmol・L-1 和0.22μmol・L-1 .采用微孔滤过膜双层过滤除菌，避光保存备用.接种细胞预培养12h使悬浮细胞贴壁，然后换以新的培养液，使ATRA和NaPA达到所需的浓度.实验分为:空白对照组，实验组分10μmol・L-1 ATRA处理组，2.5mmol・L-1 NaPA处理组，联合处理组.以上各组均含终体积分数为0.17mL・L-1 的乙醇.对照组及处理组细胞经作用后，胰酶消化，PBS洗涤、离心，30g・L-1 戊二醛固定，于光镜及电镜下观察细胞形态.细胞接种于培养瓶中约108 ・L-1 ，培养24h后换含受试物的培养液，培养1wk.每日取3瓶不同组细胞，用2.5g・L-1 胰蛋白酶消化后，台盼蓝染色，于细胞计数板内计数，绘制细胞生长曲线.细胞以1000个细胞/孔接种量接种于96孔培养板，用各组药物连续处理1wk，以MTT染色法逐日测定.实验终止前4h向细胞液中加入MTT15μL，细胞被染色后，以DMSO100μL溶解染料，于酶标仪上测定吸光度A值（490nm）.细胞以108 ・L-1 接种于25mL培养瓶中，24h后换含受试物的培养液，每日收集实验组和对照组细胞培养液，4000r・min-1 冰冻离心5min，取上清液冻干浓缩后作AFP测定，AFP的测定采用放射免疫测定法，按试剂盒说明书进行，计算1×106 个细胞AFP的分泌量.SMMC-7721细胞经不同实验组处理后，经胰酶消化，700mL・L-1 乙醇固定，加PI50mg・L-1 染色，流式细胞仪分析细胞周期.
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 形态学观察 经ATRA和NaPA作用后细胞胞体突触受抑制，细胞大多呈圆形成椭圆形，形态相对规则，对照组细胞则呈多形性.细胞多散在生长，堆集现象减少，培养6d可有胞质空泡出现，细胞逐渐老化.电镜观察显示处理后细胞胞核变得相对规则，呈圆形或卵圆形，核膜平整，未见深切迹，多数细胞仅有一个核仁，染色质变得细而分散.细胞质相对增多，细胞器发达，分泌泡增多.细胞膜较对照组相对规则，微绒毛变化不明显.
　　
　　2.2 细胞生长 SMMC-7721细胞经10μmol・L-1 ATRA，2.5mmol・L-1 NaPA及两者联合作用，3个处理组均出现HCC细胞增殖的明显抑制，且抑制作用随时间延长而增强，ATRA组和NaPA组之间无显著性差异（P&>0.05），但两者联合作用比单独作用抑制明显增强（P&<0.05，Fig1）.
　　
　　2.3 细胞增殖抑制率 活细胞特别是增殖细胞线粒体内的脱氢酶可将MTT代谢成蓝紫色结晶，并沉积于细胞内，其量与细胞增殖程度呈正比，MTT法 测定反映活细胞量.检测细胞增殖抑制率，联合处理组抑制率明显大于任一组单用，其7d抑制率可达66.5%（Tab1）. 转贴于 　　图1 略
　　表1 MTT比色法检测SMMC-7721细胞增殖　略
　　
　　2.4 甲胎蛋白分泌量 不同处理组的作用对SMMC-7721细胞AFP分泌量均呈周期性变化（Fig2）.于3d达到高峰，后逐渐下降，至最低点又开始上升，此与细胞周期存在相关性.同一培养日数，经ATRA，NaPA及联合作用细胞AFP分泌量均明显少于对照组细胞.
　　
　　2.5 细胞周期 流式细胞仪分析结果表明，与相应对照组相比，ATRA处理组可使细胞G0 /G1 增加，S，G2 +M下降（Tab2）.NaPA处理组可使细胞G0 /G1 增加，G2 +M下降，S变化不大.联合处理组对细胞周期各阶段均有明显影响.G0 /G1 是细胞进入分裂期的重要阶段，G0 /G1 增加则进入分裂期的细胞减少.S期是细胞DNA合成期，S期减少则影响DNA合成.由此而抑制细胞增殖，促进细胞分化及凋亡.
　　3 讨论
　　
　　目前诱导分化剂被广泛的应用于肿瘤的研究，在肿瘤的预防和治疗方面已取得一定的进展，其中以维甲酸类药物效果肯定［2，3］ .但诱导剂应用时间过长，剂量过高会带来一系列的毒副作用，并可使患者产生抗药性.因此，联合应用分化诱导剂以及分化诱导剂与其他作用机制不同的化合物联合应用.苯乙酸广泛存在于生物体内，是苯丙胺酸在体内经脱氨基生成的一种代谢产物.对机体无毒性及副作用，苯乙酸钠可与谷氨酰胺结合，降低血浆中谷氨酰胺的水平，选择性诱导细胞生长抑制，影响DNA的合成，从而阻止细胞的生长而诱发凋亡.其诱导方式和作用环节与维甲酸类不同，因此，进行有效的联合用药，可在多个环节上发挥诱导分化作用.ATRA和NaPA联合应用于治疗神经母细胞瘤，NaPA可增加维甲酸受体的表达［4］ .小剂量的ATRA可增强NaPA诱导HL-60细胞分化成熟，使其N-myc水平较单用NaPA或ATRA时进一步下降.
　　
　　图2 略
　　表2 ATRA/NaPA对SMMC-7721细胞周期的影响　略
　　　　
　　肿瘤细胞的特点为细胞形态各异，并且增殖速度 非常迅速，细胞分化和细胞增殖是一对矛盾，抑制增殖可促进分化，反之亦然［5，6］ .本结果表明，10μmol・L-1 ATRA，2.5mmol・L-1 NaPA抑制SMMC-7721细胞的增殖和使其处于分裂相的细胞显著降低，而且联合作用效果强于单独作用的效果，各组细胞经台盼蓝染色均未见死亡细胞，在培养过程中，各处理组细胞由形态各异转变为基本上以多角形细胞为主，细胞形态发生了显著变化.ATRA，NaPA及其联合作用均能降低HCC细胞的恶性程度.且随时间增加，细胞增殖抑制率逐渐增大，联合处理组7d抑制率可达66.5%.AFP是胚胎肝、再生肝及HCC细胞分泌的一种癌胚蛋白，各处理组细胞AFP分泌量较对照组显著降低，可能是全反式维甲酸、苯乙酸钠抑制了AFP基因的过量表达.细胞周期分析表明，NaPA处理组细胞G0 /G1 期增大，G2 +M减小，S期无明显变化.ATRA处理组细胞G0 /G1 期增大，S，G2 +M期均减小.联合处理组细胞各周期变化较显著，作用效果强于各自单独作用，其原因可能是两者药物作用于不同的环节，相互促进的结果.
　　参考文献:
　　
　　［1］Zhang YJ，Xia T，Zhao JB.Effects of Matrine on the differenti-ation of SMMC-7721cell lines ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（3）:340-343.
　　［2］Zhou HG，Gu GW.Retinods preventing liver cancer ［J］.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi（World Chin J Digestol），1999;7（1）:82-83.
　　［3］Xin XY，Chen BL，Wang TD.Expression of gap junction pro-tein connexin43in HeLa cell line and its effect on gap junctional intercellular communication ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（3）:369-371.
　　［4］Mark WL，Peter JP，Noel PB.Retinioc acid and interferon-αact synergistically as antiangiogenic and antitumor agents against human head and neck aquamous ［J］.Cancer Res，1998;58（24）:5551-5558.
　　［5］Xue Y，Xia T，Zhao JB，Wu SH，Zhang ZH，Wang ZR.Cur-cumin inhibits human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（5）:S84-S86.
　　［6］Shao CH，Zhu F，Yan W，Zhao ZL，Cai YB，Wang CJ，Shao GX.Cloning of apoptosis-related genes from prostate cancer cell line DU-145induced by all trans retinoic acid ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（6）:757-760.