关于OCT浸润提高豚鼠内耳恒冷箱的切片质量

作者：刘惠玲　胡金玮　王百忍　鞠躬


【关键词】 豚鼠耳蜗
　　关键词: OCT包埋剂;明胶;免疫组织化学;HE染色;豚鼠耳蜗
　　
　　0 引言
　　内耳耳蜗和前庭的病理变化是在研究有关噪声、冲击波、缺氧及耳毒性药物损伤中常采用的观察指标，内耳极易受外力挤压而变形，给制作切片带来一定困难.因此，通常用石蜡包埋1］ 或明胶包埋，进行内耳切片.Ishii等用OCT（opti-mum cutting temperature）包埋剂预先浸润组织，然后再进行恒冷箱切片，使切片质量得到改善［2］ .我们利用OCT包埋剂预先浸润内耳组织作为膜迷路的支持包埋剂进行恒冷箱切片，结果和用明胶包埋一样，使切片质量改善.
　　
　　1 材料和方法
　　孕40d白色豚鼠，用含40g L-1 多聚甲醛的0.1mol L-1 磷酸缓冲液（pH7.4）心脏灌注固定.快速取出胎鼠，剪开双侧颞骨，挑开蜗管底圈骨壁，去除镫骨，用针在蜗管顶部挑一小孔，用同样固定液做蜗管内灌注固定，随后置4℃冰箱后固定8h，置200g L-1 蔗糖溶液中过夜（4℃）.包埋方法分两种:一是明胶包埋，将一侧颞骨标本浸入10g L-1 明胶溶液，在37℃恒温箱中放置12h，再移入25g L-1 明胶溶液，在37℃恒温箱中放置12h，然后在4℃冰箱过夜，使明胶凝固，即可进行恒冷箱切片;二是OCT（Tissue Tek产品，美国）包埋:将另一侧颞骨标本从蔗糖中取出，放入20g L-1 蔗糖与OCT包埋剂1 1体积比例混合液中，室温浸泡2h，移入OCT包埋剂中室温浸泡4h，更换新的OCT包埋剂，室温浸泡6h.将两组处理标本置于托物台，Leica1800恒冷箱切片机切片，片厚10μm，贴于明胶预处理的载玻片上，-20℃冰箱保存.分别取出两组切片，室温下晾干，蒸溜水漂洗，移入Harris苏木精染液浸染胞核5min，自来水冲洗，700mL L-1 盐酸乙醇分色，水洗后切片入5g L-1 伊红乙醇溶液复染胞质1min，切片经脱水、透明、封片，光镜下观察.取出两组切片，行增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组织化学染色.切片先入甲醇-h3 O2 孵育0.5h，去除内源性过氧化物酶，然后按ABC法进行PCNA免疫组织化学反应.第一抗体PCNA为小鼠mAb（1 100，武汉博士德公司），4℃冰箱孵育24h，生物素化羊抗鼠IgG抗体（1 200，Vector公司）室温孵育2h，ABC复合物（1 100，Vec-tor公司）室温孵育1h，DAB显色.以上每步骤之间均用10mmol L-1 的KPBS漂洗3次，每次10min.用正常兔血清取代第一抗体作阴性对照. 　　2 结果
　　两种包埋方法处理的切片经HE染色后观察，均能保持耳蜗结构完整，前庭膜连续，膜迷路完好，无明显组织脱落、破碎等现象.但明胶包埋的切片用HE染色后，未洗净的明胶亦可着色，使背景增高.经OCT包埋的切片则无背景染色，对比分明.两种包埋方法处理的切片经PCNA免疫组化染色，均可见耳蜗基底膜上皮细胞核着棕色，为阳性反应.OCT包埋的切片基底膜上皮细胞核深染，同明胶包埋的切片免疫染色相比，阳性结果相似，并未因OCT预先浸润而影响免疫组化染色的结果.
　　
　　3 讨论
　　OCT包埋剂是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，目前已广泛用于免疫组化实验室中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂.又因其为水溶性，故在漂片时可溶于水，所以在以后的染色中不会增加背景染色.我们发现，经OCT预先浸润包埋后的内耳行恒冷箱切片时，箱内温度选择为-22℃时，可以轻松地切到10μm的切片，且切片平整，易贴片.
　　参考文献:
　　
　　［1］高 下，王锦玲，袁 军，李志宏.沙土鼠耳蜗腹核的生后发育［J］.第四军医大学学报，2000;21（11）:1310-1313.
　　［2］Ishii T，Kasama K，Kondo M，Takahashi T.Cryostat section-ing of formalin-fixed brain:Further attempt to improve section quality by previous infiltration with O.C.T.compound ［J］.To-hoku J Exp Med，1993;171（2）:101-105.转贴于