【关键词】 白血病
关键词: Bcl-2;砷化物;凋亡;雄黄;白血病，髓样，慢性
摘 要:目的 研究Bcl-2和Bax在硫化砷诱导的K562细胞凋亡中的表达，探讨其在硫化砷诱导的细胞凋亡中的作用. 方法 K562细胞经一定剂量硫化砷作用特定时间后，MTT法检测细胞生长、增殖状态，光镜及透射电镜下观察细胞形态及凋亡情况，S-P免疫组化染色检测Bcl-2、Bax的表达并进行图像分析. 结果 硫化砷对K562细胞生长增殖有时间剂量依赖性抑制作用;175～1400μg・L-1 硫化砷作用18～144h后，K562细胞出现凋亡细胞的形态学改变;免疫组化染色表明K562细胞低表达Bcl-2蛋白（A值为0.152±0.023，阴性对照A值0.108±0.012），硫化砷处理后对其表达无明显影响（A值为0.138±0.028，P&>0.05）.硫化砷作用后，Bax蛋白的表达量A值由0.240±0.013增加到0.316±0.021（P&<0.01）. 结论 硫化砷可抑制K562细胞的生长和增殖并诱导其发生凋亡，其机制可能与Bax蛋白上调有关.
Keywords:proto-oncogene proteins c-Bcl-2;arsenicals;apoptosis;realgar;leukemia，myeloid，chronic
Abstract:AIM To study the expression and the effects of Bcl-2and Bax protein in apoptosis of K562cell induced by ar-senic sulfide.METHODS After being incubated in culture medium containing variable levels of arsenic sulfide，cell growth and proliferation of K562cell was analyzed with MTT assay;apoptosis was detected with cell morphology by light and transmission electron microscopy.The expression of Bcl-2and Bax protein was determined with S-P immuno-histochemical stainning and imaging analysis.RESULTS After the treatment，cell growth and proliferation of K562cell was inhibited in a dose-and time-dependent manner.Morphologically，after treatment with175to1400μg・L-1 of arsenic sulfide for18to144h，K562cells presented some features of apoptosis.The baseline Bcl-2expression of K562cell was very low（A:0.152±0.023）while the absorbance（optical density）value（A）of negative control was0.108±0.012.No significant difference was found after the treat-ment（A:0.138±0.028）（P&>0.05），but the expression of Bax protein in K562cells co-cultured with arsenic sulfide（A:0.316±0.021）was increased，compared with the untreated（A:0.240±0.013）（P&<0.01）.CONCLUSION Arsenic sulfide could inhibit growth and proliferation of K562cell and induce its apoptosis.These effects may be correlated with the up-regulation of Bax protein.
0 引言
雄黄在我国传统医学中有悠久的历史，主要成分为硫化砷（As4 S4 和As2 S2 ）.近年来国内学者将其用于治疗恶性血液病，取得一定进展［1-3］ .用单味雄黄或含雄黄的复方如青黄散、慢粒片等治疗慢性粒细胞性白血病（CML）获得了较好的疗效［1］ .我们研究发现硫化砷能诱导CML细胞株K562细胞凋亡，与张晨等［4］ 的报道一致.但其进一步机制目前未见报道.Bcl-2和Bax是重要的凋亡相关蛋白［5-7］ ，为探讨其在硫化砷诱导的K562细胞凋亡中的作用，进一步阐明硫化砷治疗CML的机制，为硫化砷临床应用提供理论依据，我们研究了Bcl-2和Bax在硫化砷诱导的K562细胞凋亡中的表达.
1 材料和方法
1.1 材料 雄黄购自西安中药集团（产自湖南），经酸洗、水飞法炮制后，溶于RPMI1640（Gibco）培养液，灭菌分装，取样用原子吸收光谱法作砷（As）含量测定，用时以完全培养液稀释.MTT和二甲基亚砜（DMSO）均购自Sigma公司.MTT溶液配制同文献［8］ .鼠抗人Bcl-2，兔抗人Bax均为Maxim Biotech，Inc产品，UltraSensitiveTM S-P Kit购自福州迈新生物技术开发公司.K562细胞是一种建株于慢性髓细胞白血病急性变患者骨髓细胞的细胞株［9］ ，将细胞以2×108 ・L-1 密度接种于含或不含药物的新鲜RPMI1640完全培养液［内含100mL・L-1 小牛血清（杭州四季青产），100×103 U・L-1 青霉素，100×103 U・L-1 链霉素］中，在37℃、饱和湿度、含50mL・L-1 CO2 培养箱中进行培养，隔日换液以保证细胞密度在（2～5）×108 ・L-1 .
1.2 方法
1.2.1 细胞形态学观察 培养细胞经不同浓度硫化砷溶液作用一定时间后，涂片，分别进行Wright染色及HE染色，光镜下观察细胞形态及凋亡情况.取1×106 细胞，经戊二醛、四氧化锇固定后脱水，浸透，EPON812包埋，超薄切片，铀及铅双重染色，透射电镜观察.
1.2.2 MTT法检测细胞生长增殖状态 将对数生长期细胞以2×108 ・L-1 密度接种于96孔板，试验组加入等体积含各浓度硫化砷的培养液，对照组加入等体积培养液，每组设4个平行孔，并各设空白孔（即只加入药液和培养液，不加细胞）以调零.分别在培养18，42和70h后，加入MTT20μL，继续培养4h，离心，弃去上清，加入DMSO150μL，混匀，570nm处测A值.细胞生长抑制率=（1-处理组A值/对照组A值）×100%.重复3次取平均值.
1.2.3 免疫组化检测Bcl-2，Bax表达 按照Ultra-SensitiveTM S-P Kit说明书操作.细胞滴片经h3 O2 阻断过氧化物酶活性后，以非免疫性动物血清封闭，分别与一抗（鼠抗人Bcl-2，兔抗人Bax）室温下孵育60min，先后与生物素标记的二抗及链亲和素-过氧化物酶孵育，DAB显色，苏木素复染，光镜下观察.以上各步骤均在室温下进行，各步骤间均以pH7.4的PBS充分漂洗，每次染色均设阴性及阳性对照.结果用北航CMIAS真彩色病理图像分析系统处理，用吸光度平均值（A）代表染色强度.
2 结果
2.1 细胞的形态学观察 175～1400μg・L-1 硫化砷作用18～144h后，Wright及HE染色均可见凋亡细胞:细胞体积缩小，细胞核固缩、浓染，断裂成小团块分散在胞膜周边，而细胞膜完整.透射电镜下可见在细胞膜及核膜均完整的情况下，核染色质边集，沿核膜边缘形成月牙状电子密度增高区.
2.2 K562细胞生长和增殖 MTT实验发现，硫化砷对K562细胞生长、增殖有明显抑制作用，且此作用呈现明显的剂量及时间依赖性（Tab1）.
表1 雄黄对K562细胞生长和增殖的抑制率 略
2.3 Bcl┐2和Bax的表达 Bcl-2蛋白借其末端一个由19个氨基酸组成的疏水性羧基末端与膜相连，定位于细胞膜、内质网、线粒体膜及核膜上.免疫组化染色表明K562细胞Bcl-2蛋白表达很低，硫化砷处理对其表达无明显影响（Fig1）.图像分析测阴性对照A值为:0.108±0.012，K562细胞Bcl-2蛋白基础表达量A值为0.152±0.023，硫化砷处理后A值为0.138±0.028，无显著性差异（P&>0.05）.Bax蛋白主要定位于细胞质，K562细胞经硫化砷处理后，Bax染色强度明显增加（Fig2）.图像分析测定硫化砷处理前后，Bax蛋白表达量A值分别为0.240±0.013和0.316±0.021，差异显著（P&<0.01）.
已有的研究发现CML发病与凋亡受抑有关［9，10］ .我们发现，硫化砷在175μg・L-1 及以上浓度时能抑制K562细胞的生长、增殖并诱导其凋亡，说明在一定剂量下，硫化砷可通过抑制细胞增殖、诱导凋亡而起作用.现已发现许多基因与细胞凋亡有关，包括bcl-2家族、Apo-1/Fas（CD95）、c-myc、白细胞介素-1β转化酶（ICE）家族（即Caspases家族）、p53等.这些基因在凋亡过程中起着不同的作用.Bcl-2蛋白家族是凋亡的主要调节者，其家族成员包括抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-XL ，Mcl-1，Al/Bfl-1和凋亡蛋白Bax，Bcl-XS，Bak，Bik和Bad.这些蛋白彼此形成二聚体，它们之间的比率影响着肿瘤细胞对各种凋亡刺激因子的敏感性或抗性，最终决定细胞的生死存亡［7，11］ .其中研究最多的是Bcl-2和Bax.Bcl-2（B cell leukemia/lymphoma-2）基因最早是从小鼠B细胞淋巴瘤中分离出来的，其编码的蛋白质由239个氨基酸残基组成，Mr 26.由于Bcl-2能够抑制许多因素介导的细胞凋亡，而引起人们的极大关注［12，13］ .Bax与Bcl-2具21%同源性，由192个氨基酸残基组成，Mr 21.Bax/Bax二聚体在体内过量表达时，可促进细胞凋亡.Bcl-2行使其功能是通过与Bax形成异二聚体机制的.半胱氨酸蛋白酶（caspases）原通过与凋亡诱导蛋白Apaf-1的Nh3 -末端区域结合而激活，抗凋亡蛋白如Bcl-XL 则可直接与Apaf-1结合，抑制它同caspases原的交联，从而抑制caspases-9的激活［14］ .而Bax则可直接拮抗Bcl-XL 的作用，它可把Apaf-1从Bcl-XL 的结合中释放出来，从而激活cas-pases，发生自身催化的化学反应，引起线粒体膜电位下降，细胞内活性氧物质升高，降解，激活内源性核酸内切酶，引起降解，形态上可见的凋亡出现［7］ .
图1 － 图2 略
我们发现，K562细胞低表达Bcl-2蛋白，与文献［6］ 报道一致.硫化砷处理后对K562细胞Bcl-2蛋白表达无明显影响，而Bax蛋白在硫化砷作用后表达明显增加.据此可认为，在硫化砷抑制K562细胞生长增殖并诱导其凋亡的过程中，Bax蛋白通过上述途径起了重要作用.由此推想，可否用基因转染等方法增强Bax蛋白的表达，来增加K562细胞对硫化砷等凋亡诱导剂的敏感性，这将是很有意义的.
参考文献
［1］Chen SY，Li XM，Liu SX.Overview of the advances in the re-search of traditional chinese medicine containing arsenic for the treatment of malignant hematologic disease ［review］［J］.Zhongguo Zhongyao Zazhi（China J Chin Mate Med），2000;25（8）:454.
［2］Wang ZY.Arsenic compounds as anticancer agents ［review］ ［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2001;48（Suppl1）:S72-S76.
［3］Chen Z，Chen GQ，Shen ZX，Chen SJ，Wang ZY.Treatment of acute promyelocytic leukemia with arsenic compounds:In vitro and in vivo studies ［review］［J］.Semin Hematol，2001;38（1）:26-36.
［4］Zhang C，Shuang SL，Lu BF，Yu LM.Apoptosis of K562cell induced by realgar ［J］.Zhongguo Zhongyi Jichu Yixue Zazhi（Chin J Des Med TCM），1999;5（3）:30.
［5］Weerasinghe P，Hallock S，Liepins A.Bax，Bcl-2，and NF-kappaB expression in sanguinarine induced bimodal cell death ［J］.Exp Mol Pathol，2001;71（1）:89-98.
［6］Kobayashi T，Ruan S，Clodi K，Kliche KO，Shiku H，AndreeffM，Zhang W.Overexpression of Bax gene sensitizes K562ery-throleukemia cells to apoptosis induced by selective chemothera-peutic agents ［J］.Oncogene，1998;16（12）:1587-1591.
［7］Adams JM，Cory S.The Bcl-2protein family:Arbiters of cell survival ［J］.Science，1998;281:1322-1326.
［8］Hu DH，Margaret AH，Chen B，Xu MD，Jia CY，George WC.The investigation on the way to obtain the histological informa-tion of the cells during performing the MTT-methods ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（11）:1009-1012.
［9］Wang W，Sun BZ，Yu WB，Feng Q.Growth of K562cells and the expression of cyclin D1gene and bcr-abl fusion gene effected by Genestein ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（13）:1172-1175.
［10］Shang ZC，Sun BZ，Feng Q，Wang CH，Xie XP，Song TT，Zhu HF.The synergistic effects of bcr-abl and c-myc anti-sense oligodeoxynucleotides on chronic myeloid leukemia ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（3）:275-277.
［11］Wang Y，Sun GL，Wu WL，Yao YY，Xiao DM，Su H，Xiog SM.Preliminary study on the effects of Bcl-2family in apopto-sis induced by hemoharringtomine on K562cell ［J］.Shanghai Di-er Yike Daxue Xuebao（Acta Univ Med Second Shanghai），2001;21（4）:289-291.
［12］Wang WQ，Liu YF，Zhao XD，Gao TW.AK auto Ab inhibits proliferation of KC and SCC ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（9）:1165-1167.
［13］Zhang HZ，Fan QY，Wang WL，Liu B.Significance of bcl-2，MDM2and nm23gene expression in giant cell tumors of bone ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（12）:1054-1056.
［14］Perkins C，Kim CN，Fang G，Bhalla KN.Arsenic induces apop-tosis of multidrug-resistant human myeloid leukemia cells that express Bcr-Abl or overexpress MDR，MRP，Bcl-2，or Bcl-xL ［J］.Blood，2000;95（3）:1014-1022.