关键词: 脊髓损伤;慢性病;神经组织蛋白质类;受体，细胞表面
摘 要:目的 观察神经营养素在慢性压迫性脊髓损伤后及减压后的表达变化. 方法 同龄Wistar大鼠60只，设A组正常对照组、B组行后路渐进式慢性压迫、C组减压组、D组手术组，应用免疫组化方法观察各组脑源性神经营养因子、（BDNF），胶质源性神经营养因子（GDNF），神经营养素-3（NT-3），神经营养因子（NGF）及其受体TrkA，TrkB，TrkC表达的变化. 结果 行慢性压迫后及减压后神经营养素及其受体表达变化明显，各组差异有显著性意义.与正常组与假伤组比较，慢性压迫后1d的标记指数BDNF（32.4±1.6）vs（4.8±1.0），GDNF（21.2±3.8）vs（3.7±1.1），NT-3（26.2±2.8）vs（5.5±0.6），NGF（9.2±0.9）vs（1.7±0.4），TrkA（23.7±1.7）vs（0.6±0.5），TrkB（34.3±3.3）vs（3.2±0.5），TrkC（30.1±3.9）vs（1.2±0.4）（P&<0.05）.与正常组与压迫30d组比较，减压后1d的标记指数BDNF（30.2±1.6）vs（5.8±1.8），GDNF（20.0±3.6）vs（3.6±1.1），NT-3（25.8±2.3）vs（5.6±0.5），NGF（8.7±0.7）vs（1.7±0.4），TrkA（21.4±4.2）vs（0.7±0.4），TrkB（32.7±3.3）vs（3.5±0.5），TrkC（28.7±3.8）vs（1.2±0.6）（P&<0.05）. 结论 神经营养素在慢性压迫性脊髓损伤中起到了保护性作用，减压可能通过激活了神经营养素的表达起到了减轻神经损伤和保护神经功能的目的.
Keywords:spinal cord injuries;chronic disease;nerve tissue proteins;receptors，cell surface
Abstract:AIM To explore the expression of neurotrophins in chronic compressive spinal cord injury.METHODS 60Wistar rats were pided into normal，chronic compressive spinal cord injury，decompression and control groups.Im-munohistochemical method was used to observe the changes of BDNF，GDNF，NT-3，NGF and TrkA，TrkB，TrkC in each group.RESULTS After compression and decompres-sion，the neurotrophins and their receptor had some signifi-cant changes.Compared with the normal and control groups，1d after compression，the labeling indexes were BDNF（32.4±1.6）vs（4.8±1.0），GDNF（21.2±3.8）vs（3.7±1.1），NT-3（26.2±2.8）vs（5.5±0.6），NGF（9.2±0.9）vs（1.7±0.4），TrkA（23.7±1.7）vs（0.6±0.5），TrkB（34.3±3.3）vs（3.2±0.5），and TrkC（30.1±3.9）vs（1.2±0.4）（P&<0.05）.Compared with normal and30-day com-pressive groups，1d after decompression，the labeling index-es were BDNF（30.2±1.6）vs（5.8±1.8），GDNF（20.0±3.6）vs（3.6±1.1），NT-3（25.8±2.3）vs（5.6±0.5），NGF（8.7±0.7）vs（1.7±0.4），TrkA（21.4±4.2）vs（0.7±0.4），TrkB（32.7±3.3）vs（3.5±0.5），and TrkC（28.7±3.8）vs（1.2±0.6）（P&<0.05）.CONCLUSION Neu-rotrophins have some protective effect on chronic compressive spinal cord injury.Decompression relieves the nerve injury and protects the nerve function by activating neurotrophins.
0 引言
创伤日益常见，伤及脑脊髓者不少，后果严重.目前脑脊髓损伤后的保护和修复方面的研究取得了令人瞩目的成果［1-4］ .慢性脊髓压迫性疾病是神经系统常见疾患，如肿瘤和各种原因所致的椎管狭窄，是一组具有占位性特征的椎管内病变［5］ .病理上具有缺血和创伤两方面的改变.大量研究表明［6，7］ 脊髓损伤后，神经营养素（neurotrophins）及其受体表达明显增加，神经营养因子受体（neurotrophic factors re-ceptor，NTFR）在损伤脊髓的轴突及神经胶质的反应方面也起重要作用，神经营养因子（Neurotrophic factors，NTF）对脊髓损伤后的恢复产生着重要的作用［8］ .我们设计了后路渐进慢性压迫性脊髓损伤动物模型，应用免疫组织化学方法检测了不同程度慢性压迫性脊髓损伤后及减压后神经营养素及其受体表达的变化规律.
1 材料和方法
1.1 材料 体质量300～350g的雄性Wistar大鼠（兰州医学院提供）60只，随机分为4组:A.空白对照组（n=5），不施行任何手术;B.慢性脊髓压迫组（n=25），用20g L-1 戊巴比妥钠40mg kg-1 ip麻醉，常规消毒扑巾，取后正中切口，切除L4 棘突，行椎板钻孔，用直径3mm，螺距0.5mm的塑料螺钉旋入L4椎板，每隔3～5d显露螺钉，将螺钉旋入0.1～0.3mm，最终使50%脊髓受压.压迫过程中1，3，10，20，30d取材，5只 次-1 ;C.减压组（n=25），同上法制作成50%脊髓压迫模型，压迫30d后行减压术，取出螺钉.减压1，3，10，20，30d后取材，5只 次-1 ;D.假手术对照组（n=5），行椎板钻孔而无压迫装置，余处理与实验组相同，30d后取材.脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factors，BDNF），胶质源性神经营养因子（glial-derived neurotrophic fac-tors，GDNF），神经营养素-3（neurotrophic factors，NT-3），神经营养因子（nerve growth factors，NGF），TrkA，TrkB，TrkC抗体购自北京中山公司，工作浓度1 50.
1.2 方法 分别于压迫1，3，10，20，30d及减压后1，3，10，20，30d用20g L-1 的戊巴比妥钠（40mg kg
-1 ）ip麻醉，经左心室插管后剪开右心耳，快速灌注冰盐水200mL，待流出的液体清亮后，再灌注40g L-1 多聚甲醛约200mL，然后切除以伤段为中心长约2cm的脊髓标本.立即用40g L-1 中性甲醛固定48～72h，常规石腊包埋，连续切片，片厚4μm，分别做HE、免疫组织化学SP法染色，按SP试剂盒操作说明进行.BDNF，GDNF，NGF，NT3染色均以细胞质呈明确的棕黄色为阳性染色.随机计数100个细胞，测定上述神经营养素的标记指数.阳性细胞标记指数（LI）=阳性细胞计数/计数细胞总数×100%.重复5次，求其平均值.
统计学处理:所有计量数据均以x ±s表示，采用单因素方差分析进行样本均数间显著性检验.P&<0.05为差异显著.
2 结果
B，C组大鼠脊髓压迫后均出现不同程度的后肢肌力减退、行走缓慢、步态异常等运动功能障碍，压迫50%大鼠后肢全瘫.术后1wk运动功能有所恢复，术后3wk运动功能恢复较快，减压后恢复更快，减压 1mo后运动功能部分恢复正常.HE染色光镜下见假手术组脊髓组织灰质内神经元形态基本完整，白质轴突排列规整（Fig1）.压迫组灰质前角神经元肿胀，尼氏小体丧失，卫星现象，噬神经元现象明显，可见软化灶.白质表现为不规则的片状脱髓鞘区，胶质细胞增生，可见空泡化改变（Fig2）.减压组脊髓灰质轻度水肿、神经元肿胀，小胶质细胞和星形胶质细胞增生明显，白质胶质细胞增生明显（Fig3）.
2.1 神经营养素表达变化 手术假伤组及正常组中几种神经营养素表达呈弱阳性反应.压迫组损伤后不同时间及减压后不同时间BDNF，GDNF，NGF，NT-3表达有明显变化（Tab1，Fig4，5）.从阳性细胞形态上判断，神经营养素主要在神经元尤其是运动神经元内表达，神经胶质细胞也有神经营养素蛋白表达，但表达略迟.在脊髓前索的白质内可以看到有较多神经营养素表达阳性细胞呈串珠样排列，它们与神经轴突走形方向一致，可能是少突胶质细胞.
2.2 神经营养素受体的表达 在手术假伤组及正常组中，没有发现明显的神经营养素受体表达.慢性脊髓压迫后及减压后中神经营养素受体表达明显增加（Tab1，Fig6）.慢性脊髓压迫损伤后1d，神经元胞质内明显有神经营养素受体表达，伤后3d，神经元胞质内几乎无神经营养素受体蛋白出现，此时神经营养素受体蛋白主要位于胞膜上.压迫10d以后，神经营养素受体表达呈阴性.减压后1d，神经营养素受体又重新表达，3d后降低，10d后表达降低至一定水平.压迫组与假伤组比较有显著性差异（P&<0.05），减压组与假伤组及压迫30d组比较有显著性差异（P&<0.05）.
3 讨论
慢性压迫性脊髓损伤不仅导致脊髓继发损伤，同时也激活了机体的自身保护机制.由于神经营养素在神经损伤时具有维持神经元结构，促进神经生长与修复的作用，因此目前认为，神经组织损伤后神经营养素合成增加是机体本身所固有的对抗损伤的重要方式之一［9，10］ .神经系统受到多种损伤后，均会导致如c-fos，c-jun等早期反应基因的表达，当这些基因产物结合于DNA的某一结合位点（AP-1）时，就会激活位于其下游的神经营养素编码基因，使神经营养素生长增加，有效的减轻神经元损害.我们观察到，慢性压迫性脊髓损伤后，神经元及神经胶质细胞中神经营养素表达明显增加，以BDNF尤为明显.在脊髓白质中BDNF表达阳性的神经胶质细胞呈串珠样排列，且与神经轴突走行方向一致，提示可能是少突胶质细胞.研究证实，脊髓损伤后应用外源性神经营养素不仅可以减轻神经损伤［11］ ，而且还可以促进神经功能恢复［12］ .NGF对受伤的脊髓有明显的保护作用，其保护作用与稳定钙离子水平、抑制一氧化氮和兴奋性氨基酸的毒性作用有关［13］ .有研究认为，脊髓损伤后在损伤区域周围组织中BDNF合成增加有利于减轻神经损害.体外研究证实，神经元去极化后诱导神经元内BDNF合成增加可有效地减少神经元死亡，与神经营养素表达相一致.我们观察到，慢性压迫性脊髓损伤后，其他神经营养素也有表达，但表达较弱.这可能是脊髓组织本身对各种神经营养素依赖程度不同的原因. 图1 － 图6 略
我们观察到慢性压迫性脊髓损伤后神经营养素受体TrkA，TrkB，TrkC均有明显增加并持续一段时间，且TrkB的表达明显高于其他两种受体的表达.研究认为胶质细胞表达神经营养素受体增加有利于增加损伤局部的神经营养素浓度，神经元表达神经营养素受体增加有利于神经元通过自分泌方式使其本身所产生的神经营养素发挥作用.而胶质细胞产生的神经营养素则可通过旁分泌方式作用于神经元表面的神经营养素受体，减轻神经元损害.我们观察到，不仅有BDNF阳性的神经胶质细胞位于神经元周围，而且神经元本身也表达神经营养素，因此神经元可通过自分泌和旁分泌两种方式加强神经保护.
表1 大鼠脊髓慢性压迫及减压后BDNF，GDNF，NT-3，NGF，TrkA，TrkB，TrkC的表达 略
减压后，神经营养素及其受体再一次升高，提示减压可以激活神经营养素及其受体的表达，促进脊髓功能恢复.可见，慢性压迫性脊髓损伤后不仅导致了脊髓继发损伤，同时也激活了机体内源性保护机制;减压通过激活此机制，达到了减轻脊髓继发损伤和减轻神经损害的目的.增加内源性神经营养素及其受体的表达可能成为减轻脊髓损伤的有效途径之一.
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