作者：赵宁 张英起 王增禄 高连用 顾以保 李全胜 蔡永明 曾勇 陈拯民 刘昌孝
【关键词】 肿瘤坏死因子α
关键词: 肿瘤坏死因子α;药代动力学;放射测量术;小鼠
摘 要:目的 研究新型重组人肿瘤坏死因子（nrhTNFα）在小鼠体内的药代动力学. 方法 采用125 I标记的nrhTNFα同位素法，观察im和iv后的体内过程. 结果 按10，20和40μg・kg-1 3个剂量给小鼠im nrhTNFα后在1～2h达到峰浓度，总放射性在体内消除较快，t1/2 为4.7～6.5h，所得结果均证明Cmax 和AUC与剂量呈显著相关（r=0.95），与iv给药（10μg・kg-1 ）的血药浓度进行绝对生物利用度试验，其im给药生物利用度为0.803.nrhTNFα在体内的分布以肾含量最高，脑浓度最低，但都低于同时间的血药浓度.按10μg・kg-1 im给药后，用RA法测定尿和粪24h放射性总量，尿中放射性回收率为86.8%，粪中回收率为9.5%，总排泄量达给药剂量的96.3%. 结论 nrhTNFα在小鼠的体内代动力学符合二室模型.
Keywords:tumor necrosis factor;pharmacokinetics;radiom-etry;mice
Abstract:AIM To study the pharmacokinetics of new re-combinant human tumor necrosis factor alpha（nrhTNFα）in mice.METHODS 125 I isotope labelled nrhTNFαmethods were used.RESULTS nrhTNFαcan rapidly enter into blood circulation after the mice are given nrhTNFαim in10μg・kg-1 ，20μg・kg-1 and40μg・kg-1 in then it reached the peak concentration in1～2h，t
1/2 was4.7～6.5h.The re-sults from the three doses demonstrate that Cmax and AUC are related to doses significantly.The absolute bioavailability of nrhTNFαgiven imwas0.803，compared with blood concen-trations obtained by iv in10μg・kg-1 .The levels of nrhTNFαin blood ranked first，kidney second，and brain last.After the mice are injected im in10μg・kg-1 ，86.8%radioactivity is recovered from urine，9.5%from feces，total discharge amount is up to96.3%of the amount given.CON┐CLUSION The pharmacokinetic of nrhTNFαin mice could be applied to two compartment model.
0 引言
TNF已经得以广泛研究和应用［1-9］ .用基因工程技术生产的重组人TNF-α显示出与天然TNF相同的体内外抗肿瘤活性［10］ .但因其毒性太大［11］ ，未被FDA批准上市，因此各国都在研制TNF衍生物，以降低毒副反应.本中心研制了一种新型重组人肿瘤坏死因子（nrhTNFα）.我们在药效学研究的基础上，参考nrhTNFα在小鼠药代动力学的研究文献［12-15］，采用125 I标记nrhTNFα的放射性同位素法（RA）进行了nrhTNFα的小鼠药代动力学研究.
1 材料和方法
1.1 材料 nrhTNFα为本中心制备，经HPLC-GFC分析，纯度为97.5%.FT-630型γ计数仪购自北京核仪器厂.昆明种小鼠，雌雄兼用，体质量18～22g，由天津药物研究院动物室生产并提供.125 I-nrhTNFα的制备采用Iodogen法进行nrhTNFα的125 I标记.使用sephacyl S-200凝胶色谱柱分离纯化125 I-nrhTNFα，测定放射浓度为1.48×109 Bq・L-1 ，放射比活性为1.59×109 Bq・mg-1 ，放射化学纯度在95%以上.
1.2 方法 放射活性测定法（RA法）按文献［15］进行.
2 结果
2.1 总放射性浓度 3组小鼠按10，20和40μg・kg-1 125 I-nrhTNFα剂量给药，im，另一组小鼠按10μg・kg-1 125 I-nrhTNFα剂量给药，iv，分别于0.083，0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，16，24h，由眼眶采血，分离血清，取血清20μL置于测定管中，进行放射性测定.每时间点取6只小鼠，3雌3雄（Fig1）.可见肌注给药组吸收迅速，各时间点的总放射活性与给药剂量相关.将相同剂量（10μg・kg-1 ）、不同给药途径（im和iv）、不同时间的总放射活性进行比较，可见，给药2h后，两种途径给药的总放射性变化趋势基本一致.
图1 略
2.2 药代参数 将Fig1的实验数据用3P87药代计算程序进行数据处理，不论静脉还是肌肉给药，均以二室模型拟合药物浓度“-”时间曲线为适宜，自动计算出药代参数，肌肉给药的t1/2α 在0.19～0.33h范围，t1/2β 在5h左右，Tpeak在1h左右，Cmax 和AUC均随剂量的增加而增大，呈现明显的剂量相关（r=0.95，Tab1）.由肌肉和静脉给药的浓度数值经统计矩计算得到的AUC来计算出nrhTNF的绝对生物利用度为0.803.
2.3 组织分布 按10μg・kg-1 剂量给小鼠用药，im，0.1mL/只（含125 I-nrhTNFα1.85×104 Bq/只），给药前20min给NaI0.2mL（含NaI20mg，ip）.
给药后0.5，1，2，4，8h处死动物，取脑、心、肺、肝、 脾、肾、胃、小肠、肌肉、脂肪、卵巢、子宫、睾丸和血液，每一脏器取样100mg（不足100mg者，记录实际质量），分离血清，取20μL置于测定管中，进行总放射活性计数，再根据校正曲线计算出每克组织放射活性，每时间点取样6只动物，3雌3雄.在给药后0.5h，放射活性从高到低的顺序为血液、肾、肺、肝、小肠、肌肉、胃、心、脂肪、脾、卵巢、睾丸、子宫和脑;给药后8h仍能测到放射活性，其分布顺序为血液、肾、肺、肝、胃、肌肉、脾、心、小肠、脂肪、睾丸、子宫、卵巢和脑（Fig2）.
表1 总放射性测定的nrhTNFα药代参数 略
图2 略
2.4 排泄实验 小鼠4只，2雌2雄，按前法用NaI处理，给予nrhTNF10μg・kg-1 （含125 I-nrhTNFα1.85×104 Bq/只，im）放入代谢笼内，收集0-2，2-4，4-8，8-12，12-24h的尿样和粪样.取尿样置于测定管内，用γ-计数器测定放射活性，结果从累计放射量来看，给药后2h由尿排泄约为给药剂量50%的放射量，给药24h排泄86%的放射量，表明125 I-nrhTNF主要是由尿排泄（Fig3）.将收集到的粪样制成匀浆后测定不同时间段的放射活性（Fig3），24h累计粪排泄量为所给剂量的9.5%，而且主要是给药后8h内排泄的.
3 讨论
Ferraiolo等［12］ 给小鼠肌注rhuTNFα320μg・kg-1 后1h血清浓度最高，可达112μg・L-1 ，给药后4h，肌注与静脉给药的血清rhu TNFα浓度变化趋势基本一致，在静脉给药后t1/2α 为19min，t1/2β 为2.7h，nrhTNFα的t1/2α 为0.26h，t1/2β 为3.13h，均较rhuTNFα时间略长.RA法测定125 I-rhuTNFαim的血药浓度所得t1/2β 显著大于ELISA测定的结果，t1/2β 长达8～11h.我们应用RA法测得的nrhTNF t1/2β 也较长，达5h以上.从组织分布试验结果可见，放射性活性主要分布在血液、肾、肝、肺和小肠中，而且随着时间变化排列顺序有所变化，肺中浓度由0.5h的第3位降到1.0h到4.0h的第4位，到8.0h时又上升到第3位.说明nrhTNFα在肺内代谢相对肝中较慢，这可能也是对nrhTNFα治疗实验性肺癌效果较好的一个佐证.
多肽和蛋白质类药物的失活和消除机制十分复杂，许多组织都是潜在的分解代谢和消除部位.本实验结果表明，肾脏是nrhTNFα最重要的消除器官，nrhTNFα主要经肾由尿排泄，im给药后24h内，从尿中回收到给药总量的86.8%，从粪中回收到给药总量的9.5%.从粪中回收到的这部分可能与分布到胃肠的药物有关，尿粪24h的总回收率达到96.3%，说明本品的排泄消除去向已较清楚.而且排泄快而完全. 致 谢 第四军医大学基础部免疫学教研室金伯泉教授，刘雪松，李琦和杨琨的帮助.
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