作者：苟琳 张作明 郭守一 张萍 李莉 郭群
【关键词】 神经胶质酸性蛋白
关键词: 低氧;Müller细胞;超微结构;神经胶质酸性蛋白;细胞，培养的
摘 要:目的 探讨持续低流量缺氧条件下视网膜Müller细胞超微结构的改变及缺氧对神经胶质酸性蛋白（GFAP）表达的影响. 方法 采用透射电镜、western blot方法对缺氧条件下培养的视网膜Müller细胞进行观察. 结果 缺氧48h后，视网膜Müller细胞的超微结构发生改变，细胞内GFAP表达较对照组增高. 结论 持续低流量缺氧48h，即可对视网膜Müller细胞造成一定的损伤.
Keywords:hypoxia;Müller cells;ultrastructure;glial fibril-lary acidic protein;cells，cultured
Abstract:AIM To study the effects of hypoxia on the ultra-structure and GFAP’s expression of Müller cells.METHODS Transmission electron microscope and western-blot tech-nique were used to observe the Müller cells cultured at hy-poxia condition.RESULTS After48h of hypoxia，the reti-nal Müller cells’ultrastructure apparently changed and the glial fibrillary acidic protein（GFAP）had an increased ex-pression compared to the control group.CONCLUSION Certain lesion would happen to the retinal Müller cells when they were insulted by48h hypoxia.
0 引言
视网膜Müller细胞是一种特化的神经胶质细胞，具有维持视网膜的正常结构、营养视网膜神经元、参与构成血-视网膜屏障等多种生理功能，而且还参与视网膜的多种病理生理过程［1，2］ .视网膜组织对缺氧非常敏感，许多视网膜病变是由急性或慢性组织缺血缺氧所致.以往的研究多侧重于视网膜神经元及色素上皮细胞对缺血缺氧的反应，而对视网膜Müller细胞在缺氧条件下的反应和变化研究较少.视网膜Müller细胞作为视网膜主要的营养和支持细胞，探讨其在缺氧条件下在视网膜病理变化过程中的可能作用，将为进一步了解缺氧条件下视网膜的病理反应机制提供新的实验依据.
1 材料和方法
1.1 视网膜M・ller细胞的培养与鉴定 条件培养基的制备:每100mL条件培养基中加20mL Con A活化上清液
［3］ ，20mL加强型小牛血清，60mL DMEM/F12培养液，青霉素100U mL-1 ，庆大霉素10U mL-1 .
视网膜Müller细胞的制备:将出生5～7d的SD大鼠（由第四军医大学实验动物中心提供）麻醉处死，摘取眼球，移入超净台，在750mL L-1 乙醇中浸泡10～20s，用D-Hanks液冲洗数遍，在解剖显微镜下去除眼前节，剥取视网膜.将视网膜剪碎，并用0.5g L-1 胰蛋白酶消化10min，Hanks液终止消化，反复吹打细胞制成细胞悬液，经400目筛网过滤，以800r min-1 离心5min，弃上清，用条件培养基调整细胞密度为3×108 L-1 ，接种于塑料培养皿内，于37℃50mL L-1 CO2 培养箱内培养，24h后换液，以后每3d换液一次，待细胞长至融合以1 2方式进行传代培养.
视网膜Müller细胞的鉴定:预先在培养皿中置入盖玻片，待细胞贴壁融合后，将上述长有3～5代细胞的盖玻片取出，40g L-1 多聚甲醛固定30min，30mL L-1 h3 O2 作用15min封闭内源性过氧化物酶，用ABC法进行神经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）染色，DAB显色.
1.2 缺氧条件的建立 将传至3～5代即将融合的Müller细胞随机分为两组，一组为实验组，一组为对照组，实验组置于缺氧（50mL L-1 CO2 ，50mL L-1 O2 ，900mL L-1 N2 ）环境中［4］ ，给气方式采用持续低流量通气，约50mL min-1 ;对照组置于正常（50mL L-1 CO2 ，950mL L-1 空气）环境中，培养48h后取出.分别进行超微结构和GFAP表达的测定.
1.3 超微结构观察 即刻收集实验组和对照组细胞，25mL L-1 戊二醛预固定，10g L-1 锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂812浸透包埋，超薄切片.枸橼酸铅和醋酸双氧铀双重电子染色，透射电子显微镜观察.
1.4 GFAP表达观察 即刻收集实验组和对照组细胞，每组约1×107 个，加入匀浆缓冲液，将细胞置于冰浴中，超声波粉碎，冰浴20min后，13000g离心（4℃，20min）.取上清加入等体积2×SDS-PAGE样品缓冲液，在沸水中煮5～10min使之变性，进行总蛋白定量.将总蛋白量相等的实验组和对照组样品上50g L-1 浓缩胶，120g L
-1 分离胶，行常规SDS-PAGE电泳.取出SDS-PAGE凝胶，将其转移至NC膜上.转移后取出NC膜，浸于丽春红S工作液中1min，去离子水漂洗2次，剪下Marker用考马斯亮蓝染色，其余部分用ABC方法行GFAP染色.显色时待区带清晰，立刻将NC膜浸入去离子水中，终止显色.
图1 －图5 略
2 结果
2.1 培养的视网膜M・ller细胞生物学特性 原代培养的视网膜Müller细胞接种后24h即可贴壁，第一次换液时可将漂浮的及贴壁不牢的细胞洗掉，剩下的细胞则大多数为Müller细胞，同时还混杂有部分神经元细胞.原代细胞生长7～10d即可长满，随后按照1 2方式传代，传至3代以后即可得到较纯的视网膜Müller细胞.原代培养的细胞胞体较小，连接紧密，多呈不规则形状，折光性暗，镜下可见细胞分成两层，上层细胞胞体小，折光性强，可带有突起.下层细胞胞体大，折光性暗，相互间界限不清.传代后细胞呈单层，胞体变大，折光暗，可见粗大突起.选取3～5代的细胞进行GFAP染色，阳性细胞在90%以上（Fig1）.
2.2 电镜观察结果 对照组视网膜Müller细胞核仁较明显，线粒体狭长，嵴较多，有发达的高尔基体和散在的溶酶体，粗面内质网结构清晰（Fig2）.缺氧组的Müller细胞胞核内异染色质呈斑块状，大部分于核周边凝集，滑面内质网膨大并充满匀质性物质（Fig3）;多数细胞线粒体由狭长形变为圆形，嵴排列疏松（Fig4）;细胞胞质及细胞微绒毛内有大量糖原堆积（Fig5）.
2.3 Western blot结果 用GFAP的特异性抗体进行的western blot观察，可发现缺氧组和对照组在Mr 49×103 处均有GFAP蛋白表达，但缺氧组表达明显较对照组高（Fig6）.
图6 视网膜Müller细胞表达GFAP的western blot结果 略
3 讨论
Müller细胞是视网膜内的一种特殊类型的神经 胶质细胞，主要作用是对视网膜内各种神经元起营养和支持作用，同时参与调节神经突触传递，也是构成血-视网膜屏障的重要成分.近年来，越来越多的研究表明，Müller细胞还在视网膜内的多种疾病的病理进程中起重要作用［2］ .本实验中，我们采用体外培养的Müller细胞作为模型，运用低流量持续缺氧模拟视网膜慢性缺血时的在体环境，观察了在正常和缺氧条件下，Müller细胞的超微结构变化和细胞骨架蛋白GFAP的变化情况.
缺氧不仅引起Müller细胞的代谢发生变化，还可导致细胞骨架成分的改变.GFAP是一种中间丝蛋白，是构成细胞骨架的一种蛋白成分，在视网膜内，通常仅神经节细胞/神经纤维层的星形胶质细胞表达GFAP.但当大鼠眼压升高引发的缺血再灌注后GFAP会持续增高2wk，并引发Müller细胞表达GFAP，这一过程与神经细胞的损伤过程相当［6］ .通常，中枢神经系统受到损伤后，胶质细胞的GFAP表达均会有急剧的上升，并且从损伤区向周围扩展，表达的水平同损伤的严重程度有关［7］ .以往的研究表明，正常在体条件下，Müller细胞GFAP的表达是很微弱的，而各种损伤刺激，均会使Müller细胞的GFAP表达有很大增强［8］ .我们通过western blot的方法发现，培养的Müller细胞通常会有少量GFAP的表达，在缺氧以后，Müller细胞的GFAP表达明显增加.本实验中，Müller细胞在缺氧作用结束时，细胞并未大量死亡，但细胞的超微结构发生了改变，这一形态变化同GFAP的高表达有关，并可能参与缺氧损伤时Müller细胞的增殖反应［9］ .
本研究结果表明，在慢性缺氧实验条件下，视网膜Müller细胞的超微结构和细胞骨架都会发生变化，这种变化对维持视网膜神经细胞的正常功能有何意义是一个值得研究的问题.
参考文献
［1］Arroyo JG，Ghazvini S，Char DH.An immunocytochemical study of isolated human retinal Muller cells in culture ［J］.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，1997;235（7）:411-414.
［2］Newman E，Reichenbach A.The Müller cell:A functional ele-ment of the retina ［J］.Trends Neurosci，1996;19（8）:307-312.
［3］Peng GH，Li ZJ，Li C.Conditioned primary culture of retinal Müller cell ［J］.Yanke Yanjiu（Chin Ophthal Res），1998;16（1）:13-15.
［4］Du HJ，Guo SY，Zhang ZM，Luo GD，Gou L.Stimulative ef-fects of hypoxia on bovine tetinal pigment epithelial cell prolife-ration and c-fos oncogene expession in vitro ［J］.Yanke Yanjiu
（Chin Ophthal Res），1997;15（4）:239-240.
［5］Buchi ER.Cell death in rat retina after pressure-induced is-chaemia-reperfusion insult:Electron microscopic study.II.Outer nuclear layer ［J］.Jpn J Ophthalmol，1992;36（1）:62-68.
［6］Kim IB，Kim KY，Chun MH.Reaction of Müller cells after in-creased intraocular pressure in the rat retina ［J］.Exp Brain Res，1998;121（4）:419-424.
［7］Landis DMD.The early reactions of non-neuronal cells to brain injury ［J］.Ann Rev Neurosci，1994;17:133-151.
［8］Robbins SG，Conaway JR，Ford BL，Roberto KA，Penn JS.Detection of vascular endothelial growth factor（VEGF）protein in vascular and non-vascular cells of the normal and oxygen-injured rat retina ［J］.Growth Factors，1997;14（4）:229-241.
［9］MacLaren RE.Development and role of retinal glia in regenera-tion of ganglion cells following retinal injury ［J］.Br J Ophthal-mol，1996;80（5）:458-464.