作者：陈蕾 黄威权 孙绪德 吕宝真 蒲若蕾
【关键词】 胃壁细胞
关键词: 胃壁细胞;细胞分离;细胞培养
摘 要:目的 完成胃壁细胞分离及纯化，建立原代培养胃壁细胞的方法. 方法 制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育，并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞，Percoll梯度离心富集胃壁细胞，用含100mL・L-1 血清的PBS或培养液，时差贴壁去除成纤维细胞，然后，将壁细胞接种于培养板中，培养液用无血清的1∶1Harm’s F-12/DMEM培养，内含胰岛素5mg・L-1 ，氢化可地松4μg・L-1 ，转铁蛋白5mg・L-1 ，硒酸钠5μg・L-1 ，牛血清白蛋白2g・L-1 ，表皮生长因子25μg・L-1 ，葡萄糖1.98g・L-1 持续培养可达1wk以上. 结果 获得的壁细胞经吖啶橙（acridine orange，AO）鉴定纯度达80%以上，原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长，且生长状态良好. 结论 此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养，为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础.
Keywords:gastric parietal cell;cell isolation;cell culture
Abstract:AIM To establish a new model of isolation and primary culture in vitro for further study.METHODS The stomachs of rats were reverted to form sacs with the mucosa facing outward and serosa facing inward.Pronase E solution was injected into the sac lumina.The stomachs were incubat-ed in950mL・L-1 O2 and50mL・L-1 CO2 at37℃for60min，then stirred at room temperature and the dispersed cells were collected to be loaded on a density gradient（40%～60%per cell）centrifugation.For removal of fibroblasts，the cells were suspended in PSS containing100mL・L-1 fetal bovine serum FBS and preattached in flasks coated with rat tail glue at37℃for30min.The rich parietal cells were maintained in1∶1Ham’s F-12/DMEM contained insulin5mg・L-1 ，hy-drocortaison4μg・L-1 ，tranferrin5mg・L-1 ，sodium selen-ite5μg・L-1 ，BSA2g・L-1 ，epidermal growth factor（EGF）25μg・L-1 ，D-glucose1.98g・L-1 .They were cul-tured continuously in serum-free media and survived for over one week.RESULTS Identified by acridine orange（AO），the purity of isolated and cultured rat gastric parietal cells was over80%and they grew very well.CONCLUSION Our methods and condition are suitable for the isolation and primary culture of rat gastric parietal cells.
0 引言
胃粘膜的壁细胞属于高度特异分化的终末细胞，主要功能是分泌胃酸和内因子，其分离和培养均较困难，到目前为止，大鼠胃壁细胞的分离和培养方法在国内均未见报道，我们在对大鼠胃粘膜壁细胞分离和原代培养的工作中获得了一些经验和体会.
1 材料和方法
1.1 材料 选3wk龄的雄性健康SD大鼠4～5只，均来自第四军医大学实验动物中心.链霉蛋白酶购自Merck公司，Ham’s F-12/DMEM，表皮生长因子、转铁蛋白购自Gibco公司，硒酸钠、胰岛素、氢化可地松均来自Sigma公司，Pecoll购自Pharmacia公司，二硫苏糖（dithiothreitol，DTT）购自原平皓生物技术公司，牛血清白蛋、EDTA购自华美公司.胎牛血清、HEPES购自Hycolne公司，吖啶橙购自基因公司.
1.2 方法
1.2.1 壁细胞分离及培养所需液体 Medium A:Nah3 PO4 0.5mmol・L-1 ，Na2 HPO4 1mmol・L-1 ，NaHCO
3 20mmol・L-1 ，NaCl80mmol・L-1 ，KCl5mmol・L-1 ，HEPSE50mmol・L-1 ，glucose11mmol・L-1 ，BSA10g・L-1 ，EDTA2mmol・L-1 ，pH7.4;Medium B:A组中去EDTA，加CaCl2 1mmol・L-1 ，MgCl2 1.5mmol・L-1 ;Medium C:A组中去EDTA，加CaCl2 1mmol・L-1 ，MgCl2 1.5mmol・L-1 ，DTT1mmol・L-1 ;消化液:用Mdeium A配制，链霉蛋白酶浓度为1g・L-1 ，基础培养液:Ham’s F-12/DMEM（1∶1Gibco），按要求加入NaHCO3 ，调pH在7.1～7.3，过滤除菌，分装备用.完全培养液:在基础培养液的基础上加入其他辅成分:胰岛素5mg・L-1 ，氢化可地松4μg・L-1 ，转铁蛋白5mg・L-1 ，硒酸钠5μg・L-1 ，牛血清白蛋白2g・L-1 ，表皮生长因子25μg・L-1 ，葡萄糖1.98g・L-1 和庆大霉素5mg・L-1 .Percoll贮备液为10×PBS，上述液体均过滤除菌，分装备用.
1.2.2 大鼠胃粘膜壁细胞的分离及原代培养 根据Cheng等［1］ 和Prinz等［2］ 的方法并略有改进，取非禁食雄性SD大鼠，体质量在100g左右，脱颈处死并剖腹取胃，立即放入冰冷的Hanks液中，在胃底作一约1.0cm小切口，用玻璃棒将胃翻转，使胃粘膜面朝外而浆膜面向内，用Hanks液洗去胃液膜面的食物残渣和血迹.在胃幽门部结扎，并经胃底部的切口注消化酶，每胃约2.0～2.5mL，注满为止.然后，结扎胃底部.将翻转胃囊放入Medium A中，每个囊约10mL，置于37℃消化60min，水浴振荡150次・min-1 ，每20min换一次新鲜的Medium A，整个过程皆充以950mL・L-1 O2 和50mL・L-1 CO2 .
待消化结束后，把胃囊放入Meclium B中，在室温下用磁力搅拌器轻轻搅拌60min，每15min收集1次细胞，过200目筛网，离心1000r・min-1 5min，沉淀用Medium C洗涤2次，每次离心1000r・min-1 ，5min，并用无血清的完全培养液置成细胞悬液.然后综合Schepp等［3］ 的方法，并稍有改进，采用不连续分别配制40%和60%的Percoll，依次轻放入离心管中，然后把细胞悬液放到最上层，离心20min，2000r・min-1 ，4℃，则上层界面处为壁细胞，40%与60%界面处为胃主细胞、上皮细胞及少量小壁细胞，坏死的细胞碎片及少量胃粘液则位于上层的培养液内.Percoll分离后的壁细胞用PBS洗涤3次，然后用PBS（内含100mL・L-1 FBS）制备成细胞 悬液并接种到培养瓶中，放置到培养箱内时差贴壁30min以去除成纤维细胞，然后取出离心，弃上液，用无血清的Ham’s F12/DMEM培养液重新制成细胞悬液，接种至用鼠尾胶原包被的盖玻片上.
1.2.3 原代培养的大鼠胃壁细胞的鉴定 将分离或培养的壁细胞制成细胞悬液并释至适当浓度，加入终浓度为100μmol・L-1 的吖啶橙孵育5min，然后滴至载玻片上置荧光显微镜下观察（采用激发波长420～485nm，发射波长520nm），若细胞核发黄绿色荧光，胞质发红色荧光，即可确定为壁细胞，其他细胞则大多为核发黄绿色荧光，而胞质不着色［4，5］ .同时对长有壁细胞的盖玻片常规固定，作HE染色.
2 结果
2.1 壁细胞纯度 壁细胞在胃底腺中其数目约占30%左右，经Percoll分离及无血清培养之后，吖啶橙鉴定其纯度可达80%以上（Fig1）;经台盼蓝（1g・L-1 ）染色，其成活率可达95%以上.
2.2 壁细胞生长状态 将分离的壁细胞在培养之后，细胞以基底膜贴附于培养皿的底壁，且呈一种分散小组（discrete groups）样的生长，而不是均匀的铺满整个培养皿［5］ ，HE染色胞核呈紫蓝色，胞质呈红色（Fig2）.
3 讨论
胃粘膜壁细胞主要位于胃底腺的颈部和体部，约占胃粘膜上皮细胞的总数30%，是上皮细胞中体积最大的.同时壁细胞在体时受神经和体液双因素的调节，因此建立体外培养壁细胞的方法是十分必要的.以前对壁细胞分离常常是首选将胃切开，用刮刀刮取胃粘膜，然后用多种消化酶如胰酶、胶原酶和链霉蛋白酶消化等，这样将酶直接与细胞接触，造成细胞死亡大，细胞碎片很多，所得细胞很不理想，直接影响细胞的培养.我们参考Cheng等［1-3］ 的方法制备翻转的胃囊，采用链霉蛋白酶E消化，把酶注入到翻转的胃囊面（即浆膜面），这样可以避免消化酶与壁细胞直接接触，减轻了对壁细胞的损伤，而且粘膜面朝向浴液，供氧充分，同时无刮取粘膜时对细胞造成的机械损伤，利于细胞的成活.
图1 － 图3 略
以前，由于缺乏有效的壁细胞的鉴定方法，因此在壁细胞的功能研究方面取得的进展不大.近年来，荧光探针AO的发现，使壁细胞得以准确鉴定，推动了这方面的研究.AO是一种弱碱性的荧光物质，被细胞摄取后依细胞内pH值的不同而发出不同颜色的荧光，在碱性部位（如与核内的DNA结合后）则呈黄绿色荧光，而在酸性部位则发橘红色荧光.其他细胞核也可被染成黄绿色或绿色，但其胞质不着色，死细胞则被整个染成橘红色.目前AO被公认为是鉴定壁细胞的主要方法［4］ .
壁细胞的培养比较困难，常常以成纤维细胞的大量增殖而告终.在培养基中加入的血清往往可刺激成纤维细胞的繁殖而抑制壁细胞的生长，同时可能对壁细胞有毒性作用［6，7］ .因此，我们采用含有100mL・L-1 血清的FBS或培养液，时差贴壁30～45min，可去除大部分成纤维细胞，然后再换用无血清的培养液，这样可有利于壁细胞的生长而抑制残留成纤维细胞的大量繁殖，同时还可提高壁细胞的纯度.
参考文献
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