作者：席庆 毛天球 曹罡 陈富林 杨维东
【关键词】 骨髓细胞
关键词: 珊瑚;骨髓细胞;支架;生物相容性材料
摘 要:目的 探讨西沙群岛高孔隙率滨珊瑚作为骨组织工程支架材料的可行性，为组织工程研究开辟新的途径. 方法 取4wk龄兔骨髓，分离骨髓基质细胞，体外培养，经诱导分化为成骨细胞，接种至滨珊瑚材料，无菌条件下植入裸鼠皮下组织中.对照组单纯植入滨珊瑚.分别于4，8wk取材，行大体观察、X线摄影及组织学染色，观察新骨形成情况. 结果 4wk时X线片有高密度阻射影像，HE染色可见有新骨形成;8wk时X线阻射影像密度更高，HE染色可见大量新骨形成并相互连接成骨小梁样结构，骨细胞位于陷窝中. 结论 高孔隙率滨珊瑚可以作为骨组织工程的支架材料并有广阔的应用前景.
Keywords:coral;bone marrow cells;stents;biocompatible materials
Abstract:AIM To investigate the feasibility of using coral as scaffolds in bone tissue engineering.METHODS The marrow stromal cells from New Zealand rabbits of4months were harvested and cultured in vitro.After multiplied，dex-amethasone was used to promote the osteoblastic phenotype of the cells.The cells were harvested and then seeded into coral.By means of tissue engineering，osteoblastic cells/coral complexes were formed.The complexes were implanted subcutaneously in nude mice and coral alone was implanted as the control.Bone regeneration was assessed by histological and roentgenographic analysis4and8weeks after the im┐plantation.RESULTS Osteoid tissues were observed4weeks after the implantation;large amount of new bone was found8weeks after the implantation;lamellar bone was ob-served，and many osteoblasts could be seen in the bone ma┐trix.CONCLUSION The coral with higher porous rate can be used as a good scaffold material for bone tissue engineer-ing.
0 引言
组织工程学是应用细胞生物学和工程学的原理，研究和开发用于修复和改善人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的一门科学［1］ .骨的再造及骨缺损修复是组织工程领域的一个重要研究内容，支架材料研究是其中重要的组成部分.我们通过研究骨髓基质干细胞与材料的粘附及成骨能力，探讨国产滨珊瑚（Porites）用于组织工程的可行性.
1 材料和方法
1.1 材料 DMEM培养液（Gibco），胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所），胰蛋白酶（Sigma），β-甘油磷酸钠（Sigma），地塞米松（Sigma），L-抗坏血酸（Sigma），S-520扫描电镜（日本）.CO2 培养箱（美国），YJ-875型超净工作台（苏州净化设备厂），倒置显微镜（Olympus），新西兰家兔（第四军医大学实验动物中心），BALB/c裸鼠（第四军医大学实验动物中心）16只，18～22wk龄，雌雄不拘.滨珊瑚（西沙群岛），孔径170～220μm，孔隙率40%～50%，切割成直径15mm，厚度2mm大小的盘状材料，50g・L-1 次氯酸钠浸泡3d，流水冲洗过夜，用蒸馏水超声漂洗，烘干后备用.
1.2 方法
1.2.1 取材 新西兰家兔1只，4wk龄，无菌条件下取双侧髂骨，减碎成约2mm×2mm×2mm大小的组织块，用20mL含100mL・L-1 小牛血清的DMEM培养液冲洗，轻轻吹打，静置1min，取上清接种于10个培养皿中进行培养.24h后换液，去除未贴壁血细胞，以后每3d换液1次，5d后换诱导液（DMEM液，含地塞米松10-7 mmol・L-1 ，β-甘油磷酸钠10mmol・L-1 ，L-抗坏血酸50mg・L-1 ），使细胞向成骨细胞转化，形成骨髓基质成骨细胞，细胞长满后用胰蛋白酶消化传代.倒置显微镜下观察细胞生长情况.细胞长满培养皿后，用2.5g・L-1 胰酶常规收集细胞.
1.2.2 体外培养观察骨髓基质干细胞与材料粘附能力 利用含100mL・L-1 小牛血清的DMEM培养液及细胞计数器调整细胞数至4×1010 ・L-1 ，利用负压管将细胞悬液与材料充分混合，培养2wk后作扫描电镜观察.
1.2.3 体内观察滨珊瑚与骨髓基质干细胞复合成骨能力 接种方法同1.2.2，体外培养24h后，待细胞与材料贴附后植入裸鼠背部皮下组织，严密缝合.设空白对照组，分4，8wk取材，常规HE染色，光镜观察.
1.2.4 观察指标 扫描电镜观察在体外的成骨细胞在珊瑚表面生长、粘附、基质分泌和Ⅰ型胶原的生长分泌情况.分别于植入后4，8wk取材，进行大体标本观察;摄X线片（球管距标本10cm，70kV垂直投照，曝光时间0.3s）;蒋氏脱钙液脱钙，脱水，石蜡包埋，常规HE染色，观察新骨形成情况.
2 结果
2.1 骨髓基质细胞培养情况 24h细胞开始贴壁，48h开始伸展为梭形，3～5d开始增殖，5d后换液以去除血细胞成分，6～8d即可长满.传代后1d贴壁，细胞呈多角形、梭形，2～4d增殖迅速，约5～7d即可长满，长满后细胞多呈梭形，连续培养10～14d细胞呈复层生长.每培养皿可收获细胞数3×106 ～5×106 个.
2.2 扫描电镜观察结果 单纯珊瑚电镜观察见Fig1;培养2wk后，细胞在材料表面伸展贴附，有大量胶原基质形成，钙化结节存在（Fig2）.
2.3 大体标本观察 4wk时可见实验组标本呈淡红色，质硬;8wk时标本呈红色，质硬;对照组为白色，周围有软组织包裹.
2.4 光镜结果 4wk时标本镜下可见大量骨形成，成骨细胞较多，偶有软骨细胞存在，其中可见微血管（Fig3）;8wk时标本可见大量新骨形成，相互连接形成层板骨，成骨细胞位于骨陷窝中，周围有大量骨基质呈淡紫色，局部可见软骨细胞存在，新骨中有大量血管形成（Fig4）.对照组未见骨形成.
3 讨论
骨组织工程研究寻求的支架材料应具有以下条件:①良好的生物相容性;②良好的骨传导和骨诱导性;③多孔结构;④降解速率与骨组织再生速率相匹配;⑤能维持细胞的形态和表型，有利于细胞的粘附和增殖［2-5］ .
Vacanti等［6］ 用PGA为支架材料将小牛骨膜细胞接种于其中，植入裸鼠体内，成功构建了组织工程骨，但PGA价格昂贵，国内难以接受.珊瑚是一种海生无脊椎动物的骨骼，其化学成分99%为碳酸钙，还有少量其他元素和有机成分，类似无机骨.我们所用的滨珊瑚产自西沙群岛，具有与无机骨相似的微孔结构，同时具有良好的生物相容性和生物可降解性，易被加工成型，可生物降解.生物相容性好，无明显免疫原性，符合作为组织工程支架材料的主要性能.在实验中发现，将珊瑚与成骨细胞在体外复合培养，早期成骨细胞可以在珊瑚表面附着，并在其上伸展、繁殖，分泌胶原纤维与钙盐结晶等细胞外间质，同时可以附着于材料的孔隙周边或深入材料孔隙内生长.该材料除可以作为成骨细胞贴附的支架外，还能为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，排除废料，并使细胞按预制形态的三维支架生长［7］ .在新骨形成过程中，其降解产物及残留的碳酸钙成分可为新骨组织提供原料而被利用［8］ ，因此，特别适合于骨组织工程的构建.国内，Zhang等［9］ 用重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）复合天然珊瑚成功修复了兔颅骨缺损.我们所用的滨珊瑚具有三维相通的孔隙结构孔径约为170～220μm，具有多孔性和高孔隙率，不仅能为成骨细胞的贴附、增殖提供较大的表面积，使得营养物质和体液较以往所用之普通珊瑚更易到达材料深部，而且利于血管化形成.其孔隙互相交通，孔隙率高达40%～50%，孔隙率过高则材料强度下降，过低则支架材料的体积大小受到限制.本实验成功证实了国产高孔隙率滨珊瑚具有良好的生物相容性，在体外培养的条件下骨髓基质细胞可成功在珊瑚中分裂增殖，并产生钙化结节及胶原基质;在无免疫动物裸鼠体内成功构建出组织工程骨.说明了高孔隙率滨珊瑚是一种良好的组织工程支架材料，同时，它还具有来源广泛，制备简易，成本低廉等优点，具有广泛的应用前景.
参考文献:
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