作者：李石保 杨维东 唐立辉 赵信义 陈萍
【关键词】 水凝胶
关键词: 水凝胶;软骨;组织工程
摘 要:目的 制备出适合于组织工程用的温固化型水凝胶，并将其应用于可注射软骨的建造，观察实验结果. 方法 制备不同浓度的水凝胶，并添加不同的物质，测量其凝胶化温度，并把水凝胶用于裸鼠组织工程软骨的建造.注射后4，8和12wk取材，通过大体标本和组织学观察研究软骨的形成情况. 结果 250g・L-1 的水凝胶具有恰当的凝胶化温度和能满足要求的力学性能.含钙磷的添加物因溶解度不高，对凝胶的性能未能产生显著影响.此水凝胶用于软骨组织工程，注射后4wk在皮下形成稍硬的结节.8wk后形成的结节质地坚韧，切面色泽亮白.组织学观察4wk即有软骨形成，但不成熟，8wk标本有成熟软骨形成，12wk标本成熟软骨的量进一步增加. 结论 温固化型水凝胶凝胶化温度受浓度影响，250g・L-1 水凝胶凝胶化温度为5℃，可用于组织工程软骨的建造，并能顺利长出软骨.
Keywords:hydrogel;cartilage;tissue engineering
Abstract:AIM To prepare temperature dependent hydrogel and to apply it as the scaffold in fabrication of tissue engi-neering cartilage and to observe the results.METHODS Various concentration and additives of hydrogel were pre-pared，the gelation temperature were determined，the most favorite hydrogel（250g・L-1 ）was selected to be used as the scaffold of tissue engineering，and then the cartilage was fab-ricated.The chondrongenesis was studied histologically for12weeks.RESULTS Gelation temperature of250g・L-1 hydrogel was5℃，and its mechanical properties were good.However the solubility of additives was too low.The250g・L-1 hydrogel was applied in tissue engineering;4weeks after injection，the hard nubble was formed subcutaneously and immatural cartilage was observed.8weeks after injection matural catilage was observed.12weeks after injection the amount of matural cartilage increased.CONCLUSION Gelation temperature depends on the concentration of hyd-gogel，the gelation temperature of250g・L-1 hydrogel being5℃.The hydrogel could be applied in fabrication of tissue engineering cartilage，and the cartilage could be fabricated successfully.
0 引言
聚氧化乙烯-聚氧化丙烯-聚氧化乙烯（PEO-PPO-PEO）三嵌段共聚物具有优异的生物相容性，在冰淇淋和乳状液的制造中用作增稠剂、凝胶剂、乳化剂、成型剂.它的另一个用途是在药物和化妆品制备中用作有一定活性的物质和油性物的溶剂.它具有优异的流体性质，稀的PEO-PPO-PEO水溶液为牛顿流体，当浓度大于100g・L-1 时，流动性明显变差，转变为塑性流体.大于100g・L-1 的水溶液都有一个凝胶化温度，当温度低于凝胶化温度时，粘度很低，为粘性流体，温度超过凝胶化温度时，粘度急剧增高，变为凝胶.Cabana等［1］ 详细研究了共聚物水溶液的凝胶过程，他们利用线性粘弹性数据的变化测试了凝胶化温度，并认为凝胶的机理是胶束的堆积和长链大分子的互穿缠绕.Loeffer等［2］ 利用它的凝胶特性，研制出在伤口原位形成凝胶并释放凝血酶的急救包，并用于战场急救.利用它的生物相容性和凝胶化特性，Cao等［3］ 把这种水凝胶用于猪的自体软骨组织的建造.Vacanti［4］ 对水凝胶及水凝胶-软骨细胞复合体进行了研究.我们测试了以水和丙二醇为混合溶剂，不同组分浓度对溶液的凝胶化过程的影响，讨论了不同添加物对凝胶性能的影响，并成功地使用水凝胶作为支架材料，按照组织工程方法用兔耳软骨在裸鼠体内建造出成熟的软骨组织.
1 材料和方法
1.1 材料 PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物（工业级，BASF公司生产），去离子水，丙二醇（分析纯，天津市化学试剂二厂），磷酸钾钠钙（西北有色金属研究院提供），磷酸钙（分析纯，西安化学试剂厂）.新西兰兔，裸鼠（本校实验动物中心），Ⅱ型胶原酶（Sigma），DMEM培养液（Gibco），胎牛血清（浙江清湖犊牛利用研究所）.
1.2 方法
1.2.1 温度固化型水凝胶的制备 取一定量的丙二醇和水的混合溶液，添加其他活性物质，冷却至5℃以下，加PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物溶解，得溶液，再升温至室温，即可得凝胶.测试组分浓度和添加物对凝胶化温度和凝胶性能的影响.
1.2.2 软骨细胞/水凝胶复合体的形成和注射 在5℃以下将分离收集的兔耳软骨细胞［5］ 与250g・L-1 的水凝胶充分混和，使软骨细胞的最终浓度为50×109 L-1 .通过12号针头将复合体注射于3只裸鼠背部皮下组织，每个点注射0.3mL作为实验组.以单纯注射水凝胶和相同浓度的软骨细胞悬液作为对照.
1.2.3 大体标本和组织学观察 分别在4，8和12wk取材，通过大体标本和组织学观察软骨的形成和成熟情况.
2 结果
2.1 温度固化型水凝胶
2.1.1 各组分质量对凝胶化的影响 聚合物在水中的溶解性优于丙二醇，且能生成凝胶（Tab1）.
表1 各组分质量对凝胶化的影响 略
2.1.2 添加物对凝胶化的影响 添加物NaCl能完全溶解，NaCl含量增加可加速凝胶生成速度，提高凝胶强度（Tab2）.
表2 添加物对凝胶化的影响 略
2.1.3 聚合物浓度对凝胶化温度的影响 聚合物浓度太低，不能生成网状结构;浓度太高，则凝胶温度太低，凝胶速度太快（Tab3）.
2.2 动物实验结果 软骨细胞/水凝胶复合物注射后4wk标本，为皮下组织内的结节，质地稍硬.注射后8wk的标本质地坚韧，周围有薄的包膜，剖面为亮白色，与正常软骨相似.软骨细胞悬液也可见软骨样组织形成，但明显小于实验组.单纯注射水凝胶未见软骨形成.HE染色结果显示，注射后4wk标本，局部有大量成活的软骨细胞，番红O染色呈弱阳性，表明软骨基质的糖胺多糖的成分较少，形成的软骨不成熟.注射后8wk标本，HE染色可见大量的软骨位于陷窝内（Fig1），材料已被大量吸收，组织结构类似于正常软骨组织.12wk标本番红O染色为强阳性（Fig2），形成了大量的成熟的软骨组织.细胞悬液也可见软骨形成，但软骨形成量明显少于复合物注射组.单纯注射水凝胶的标本中未见软骨形成.
3 讨论
在Tab1中，从样品2和样品3可以看出，当溶剂为丙二醇时，聚合物不能完全溶解，说明聚合物在丙二醇中的溶解性不是很好.当溶剂为水时，聚合物能完全溶解，也能凝胶化.从样品1，4，5可以看出，丙二醇、聚合物含量不变，增加水的含量，通过比较观察发现，水越少，凝胶化时间越短，水越多，聚合物溶解性越好，当浓度低于一定值时，只能形成溶液，在低温和室温时都是液体.凝胶机制［6］ 为:随着温度改变，PEO-PPO-PEO溶解度降低，使之从溶液中以“胶体分散状态”析出，析出的质点既不沉降，也不能自由行动，而是因碰撞相互连结构成骨架，通过整个溶液形成连续的网状结构而形成凝胶.
图1 －图2 略
从Tab2可以看出，添加物NaCl能完全溶解，随着NaCl量的增加，凝胶化速度加快，凝胶强度有所提高，这是因为NaCl作为一种溶质，使溶液中质点增加，碰撞增加，形成凝胶更为容易，所以溶质对提高凝胶强度是有帮助的.而磷酸钙和磷酸钾钠钙在溶液中溶解度不够，对凝胶没产生明显影响.但由于含有丰富的钙磷离子，作组织工程基材时，引进这些元素有可能促进骨及软骨的生长.如含钙磷化合物 且溶解度大才较为理想.
从Tab3可以看出，聚合物浓度太低，因质点不够，不能形成网状结构而生成凝胶，浓度太高，则凝胶化温度太低，凝胶化速度太快，不好操作，故250g・L-1 是较为合适的浓度.
由Fig1和Fig2可见，水凝胶-软骨细胞复合体能长出软骨组织，且作为基材的水凝胶能够降解和有良好的生物相容性，在临床可尝试用于整容及低创伤的修复.
由PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物、丙二醇、水能形成温度固化型水凝胶，浓度为250g・L-1 时，凝胶化温度为5℃.水凝胶-软骨细胞复合体注射到裸鼠体内，能长出软骨组织，水凝胶能降解且有良好的生物相容性.
温固化型可注射水凝胶是一种有前途的载体材料，用组织工程方法进行软骨的建造是一种有前途的方法.
参考文献
［1］Cabana A，Ait-Kadi A，Juhasz J.Study of the gelation process of polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymer aqueous solution ［J］.J Colloid Interface Sci，1997;190（2）:307-312.
［2］Loeffer UT.Kit for in situ formation of topical gel for enzyme release in wounds ［P］.DE Patent:19602208（July，1997）.
［3］Cao YL，Rodriguez A，Vacanti M，Ibarra C，Arevalo C，Va-canti CA.Comparative study of the use poly（glycolic acid），calcium alginate and pluronic in engineering of autologous porcine cartilage ［J］.J Biomater Sci Polymer Edn，1998;9（5）:475-487.
［4］Vacanti CA.Tissue resurfacing with hydrogel-cell compositions ［P］.WO Patent:9717038（May1997）.
［5］Yang WD，Chen FL，Tao K，Mao TQ，Chen SJ，Gu XM.The feasibility of rabbit model for the study of tissue engineering of bore and cartilage ［J］.Shiyong Kouqiang Yixue Zazhi（Pract J Stomatol），1999;15（5）:375.
［6］Shen Z，Wang GT.Colloid and surface chemistry ［M］.Bejing:Huaxue Gongye Chubanshe（Chemical Industrial Pubilishing House），1991:103.转贴于