作者：章必成 李青 巩西启 叶菁 陈广生 王映梅 林圣彩
【关键词】 p38分裂原激活蛋白激酶
关键词: p38分裂原激活蛋白激酶;基因转染;胶质瘤;凋亡;大鼠
摘 要:目的 研究p38MAPK基因转染大鼠胶质瘤细胞系C6后对其生物学特性的影响. 方法 利用脂质体介导法将p38MAPK基因导入大鼠胶质瘤细胞系C6中，用免疫细胞化学染色检测其在细胞转染前后的表达情况，用HE染色、流式细胞仪等方法研究其对细胞形态、粘着状况和生长周期的影响. 结果 转染pCMV5-p38MAPK质粒组p38MAPK蛋白表达阳性，细胞形态发生变化，贴壁性降低，出现大量凋亡细胞. 结论 转染p38MAPK基因可诱导胶质瘤细胞凋亡.
Keywords:p38MAPK;gene transfection;glioma;apoptosis;rats
Abstract:AIM To study the effect of p38MAPK transfec-tion on the biological characteristics of glioma cell C6.METHODS p38MAPK was transfected into glioma cell C6by lipofectin.Expression of p38MAPK was detected by immunocytochemistry.HE staining and flow cytometry were adopted to measure the cell morphology，adhesion and cell cycle.RESULTS p38MAPK was expressed in transfected glioma cells，with cell biological characteristics changing and apoptotic cells emerging.CONCLUSION Apoptosis of glioma cell could be induced by p38MAPK transfection.
0 引言
蛋白质的磷酸化与去磷酸化是传递细胞各种信息的重要转导机制.蛋白激酶催化磷酸基团与蛋白质内特异的氨基酸共价结合.一系列的蛋白激酶及其磷酸化活化构成了信号转导级联反应.丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路是近年来研究较多的蛋白激酶通路.在真核细胞中，已鉴定出4条，即细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）通路，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）通路，ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶1（big MAP kinase，BMK1）通路和p38MAPK通路.它们参与了细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程，并参与细胞的恶性转化等病理过程.p38MAPK除在细胞应激、炎症反应中具有重要作用外，也与细胞的发育、分化和凋亡密切相关.胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，p38MAPK对其生长的调节作用尚不了解.我们将外源性p38MAPK基因转染大鼠胶质瘤细胞系C6，以期研究其对胶质瘤细胞生物学特性的影响，为充实信号转导在胶质瘤中的作用提供理论依据.
1 材料和方法
1.1 材料 大鼠胶质瘤细胞系C6由本教研室保存.pCMV5-p38MAPK质粒和兔抗鼠p38MAPK抗体由新加坡国立大学林圣彩教授惠赠.pCMV5质粒由本校生化教研室孙强惠赠.脂质体购自Gibco公司.免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司.
1.2 基因转染 大鼠胶质瘤细胞系C6在含150mL・L-1 小牛血清的RPMI1640培养液中常规培养，细胞生长至对数期时以2×105 /孔接种于6孔板，培养24h.将2μg pCMV5-p38MAPK，10μL脂质体分别溶于100μL无血清培养基，两溶液缓慢混匀，室温放置30min，加入0.8mL无血清培养基，混匀后加入上述培养细胞内，常规培养4h后，加入1mL含150mL・L-1 小牛血清的培养液，继续培养24h.同法转染pCMV5质粒及未转染C6细胞作为对照.
1.3 形态学检测 转染同时制备细胞爬片，转染后30h取出，PBS洗涤2次，950mL・L-1 乙醇固定15min，HE染色.
1.4 免疫细胞化学染色 细胞爬片处理同上.一抗为兔抗鼠p38MAPK抗体（1∶50），4℃过夜，加入二抗，室温30min，加入SABC复合物，DAB显色，苏木素衬染.
1.5 细胞周期分析 3组细胞各约1×10 6 个，经胰酶消化成单细胞悬液，PBS洗涤2次，700mL・L-1 冷乙醇固定过夜，用DPAI进行染色，于流式细胞仪进行细胞周期分析.
2 结果
2.1 形态学检测 转染pCMV5-p38MAPK质粒后，细胞由原来的多突起形逐渐变为双极或圆形，体积缩小，细胞内空泡增多（Fig1），贴壁性降低，36h后可见部分细胞漂浮于培养液中.pCMV5质粒组和空白对照组无明显变化.HE染色显示pCMV5质粒组和空白对照组细胞形态一致，可见大量核分裂象，转染pCMV5-p38MAPK质粒组核分裂象明显减少，细胞形态改变，密度减低，部分细胞固缩变圆，深染，胞核染色质边集，呈环状、碎块状或新月体状，可见胞质“出泡”现象，此即凋亡细胞（Fig2）.
2.2 免疫细胞化学染色 转染pCMV5-p38MAPK质粒组P38MAPK蛋白表达阳性，主要定位于胞质或（和）胞核，凋亡细胞阳性稍强，部分凋亡细胞胞核也可见阳性表达（Fig3）.pCMV5质粒组和空白对照组均未见p38MAPK蛋白表达.证实转染pCMV5-p38MAPK质粒组有外源性p38MAPK基因的表达，而pCMV5质粒组和空白对照组则无外源性p38MAPK基因.
2.3 细胞周期分析 转染pCMV5-p38MAPK质粒组、pCMV5质粒组和空白对照组G1/G2无明显变化，但转染pCMV5-p38MAPK质粒组出现明显凋亡峰，凋亡细胞占总数的34.1%（Fig4）.
图1 －图3 略
3 讨论
p38MAPK通路是1993年发现的一类MAPK通路.研究表明，细菌脂多糖（LPS）、紫杉醇（taxol）和蛋白激酶C（PKC）的特异激活剂PMA可以快速诱导某些细胞内的p38MAPK发生酪氨酸磷酸化［1］ .1994年，Han等［2］ 首先在小鼠肝脏细胞中克隆了p38MAPK基因，同时发现，p38MAPK在小鼠巨噬细胞和淋巴细胞中均有表达.p38MAPK通常由紫外线、高渗环境、砷盐、热休克、h3 O2 ，细胞因子和生理应激等激活，之后移位作用于相应的转录因子，启动某些基因转录.ATF2，MEF2C，CHOP10和SAP1等是p38MAPK的生理作用目标［3］ .
图4 略
p38MAPK在肿瘤发生发展和生长周期中的作用尚不清楚.已有的研究证实p38MAPK在肿瘤中活性升高并能诱导凋亡的发生.对胶质瘤的研究显示，多巴胺、高渗、内源性δ鸦片受体（DOR）及鸦片受体样受体1（ORL1）［6］ ，LPS及肺炎球菌胞壁成分（PCW）［7］ 等可激活p38MAPK.Hernandez等［8］ 曾在人星形胶质瘤细胞株中发现，p38MAPK可使TNF-α诱导胞质磷酯酶A2磷酸化，参与维甲酸的代谢，提示p38MAPK在人胶质瘤细胞中表达并发挥作用.在PKC特异性抑制剂calphostin C诱导人胶质瘤凋亡的研究中，Ozaki等［9］ 检测到p38MAPK的活性升高但并非calphostin C诱导凋亡所必需.我们利用脂质体转染的方法，成功地将p38MAPK基因导入胶质瘤细胞，发现其细胞形态和粘着状况均发生明显变化.经HE染色和流式细胞仪检测，发现有典型的凋亡细胞出现.p38MAPK诱导胶质瘤细胞凋亡的作用机制尚不清楚，推测可能是:p38MAPK通过转染进入胞核后，①启动某些癌基因如c-myc/s-myc，c-fos，c-jun和fas等发生转录［10］ .c-myc/s-myc可以诱导caspase的表达，后者被认为是凋亡程序的执行者;c-myc，c-fos和c-jun则构成凋亡信号网络;fas及其配体fas L是近年来受到普遍重视的介导细胞凋亡的信号转导系统.②诱导某些癌基因蛋白如p53发生磷酸化［11］ .p53蛋白是公认的与凋亡密切相关 的分子.③增加TNF-α等基因转录活性［12］ .TNF-α与其受体结合后，以与fas受体类似的途径导致细胞凋亡.有关此方面的研究正在进行中.
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