大鼠胰岛分离与纯化的实验分析

【关键词】 胰岛
　　关键词: 胰岛;分离
　　
　　0 引言
　　目前临床胰岛移植的效果仍不理想，提供理想的胰岛或胰岛细胞是发展胰岛移植的基础.长期以来收获高纯度和高活力的胰岛或胰岛细胞是人们研究的目标.本文采用胶原酶分次消化与葡聚糖间断密度梯度离心法来探讨大鼠胰腺胰岛的分离与纯化.
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 胰岛分离 SD大鼠，共10只，不分雌雄，体质量160～200g.颈椎脱位法处死后，在无菌状态下迅速取出胰腺，置于4℃Hanks液中，去除胰腺周围的结缔组织，冲洗后剪成1mm3 的碎块，加入3mL预温的1g・L-1 的胶原酶（IV型，Sigma）消化液中，置38℃水浴箱中10min，将消化下来的上层细胞悬液吸出置入含小牛血清的4℃Hanks液中，终止消化.再将剩余的胰腺组织块加入2mL1g・L-1 胶原酶液中，重复以上实验2～3次，直到胰腺组织消化完全，将得到的胰岛细胞悬液用不锈钢丝网（80目）过滤，用4℃的Hanks液洗涤2次后，制备成2mL细胞悬液，立即准备纯化.
　　
　　1.2 胰岛纯化 采用葡聚糖间断密度梯度法，取一离心管依密度大小，依次缓慢加入密度为1.112，1.091，1.083和1.044的葡聚糖液各4mL，与传统方法不同，将2mL细胞悬液缓慢加入分离液最上层，离心管加盖离心，500r・min-1 离心5min，再调至2000r・min-1 15min，收集各界面的细胞团，分别取一定量的分离物，用双硫腙染色，观察胰岛分布情况，在倒置显微镜下作胰岛计数.
　　
　　1.3 胰岛形态学鉴定 ①双硫腙染色;②碘丙啶-丫啶橙荧光染色法.
　　
　　1.4 纯度估计 用倒置显微镜下胰岛数量与外分泌组织量之比来估计.
　　
　　1.5 生物学活性测定 将纯化胰岛置于200mL・L-1 胎牛血清RPMI1640培养液中于37℃，950mL・L-1 空气、50mL・L-1 CO2 条件下培养3wk（24孔培养格，102 胰岛/孔，总液量1mL）.隔天换液，测培养液中胰岛素含量24h.胰岛素测定采用放射免疫法（胰岛素试剂盒由北京北方生物技术研究所生产）.
　　
　　2 结果
　　大鼠胰腺分离及纯化后，用双硫腙染色阳性细胞团进行比较，平均收获量600～1200个/胰腺，平均为（1012±231）胰岛/胰腺.胰岛纯度可达90%，纯化的胰岛大部分（约90%）分布在1.112～1.091和1.091～1.083葡聚糖界面中.经胶原酶消化后的大鼠胰腺组织的悬液在倒置显微镜下观察，见有大小不一，圆形或卵圆形的细胞团和散在细胞，用双硫腙染色后染成红色或猩红色的细胞团为典型胰岛，低倍镜下（10×10）观察胰岛直径大小不一，胰岛内胰岛细胞数量不等，胰岛外分泌组织不着色.碘丙啶-丫啶橙荧光染色示细胞活率&>90%（活细胞呈绿色，死细胞呈红色）.
　　
　　胰岛素生物活性测定结果显示胰岛细胞在3wk的培养过程中，均能检测到分泌的胰岛素，根据对2，4，8，14，18和21d采集每孔上清液24h胰岛素分泌量分析，发现其平均分泌量在第1周内最高［（1.62±0.51）mol・S -1 ・L-1 ］，3wk后仍可检测出［（0.16±0.04）mol・S-1 ・L-1 ］，分泌量下降与培养条件有关.
　　
　　3 讨论
　　胰岛的制备是胰岛移植的关键，我们的目的是制备出大量的高纯度、生物活性好的胰岛或胰岛细胞，在胰腺组织消化过程中，消化时间长不但降低胰岛细胞的活性，而且易形成一种粘稠的胶状物，它可网罗大量的胰岛，从而减少收获量;反之消化时间不够，胰岛的收获量会明显减少.因此作者针对以上情况，在参考国外文献报道的基础上［1-4］ ，经过反复试验摸索，采取分次消化、镜下动态观察消化情况相结合的办法，严格把握消化时间，即可使组织得到充分的消化，获得最大量的收获，达到（1012±231）胰岛/胰腺.同时该法减少了胶原酶用量，省时、方便.另外，尽量使已消化析出的胰岛减少暴露在温热酶消化过程的时间，是提高胰岛活力的一个重要因素.作者在实验中，暴露时间尽量控制在10～15min，是常规消化时间的1/2，尽量使最先被消化下来的细胞避免受到消化酶的影响，作者通过用双硫腙染色法进行观察，镜下胰岛呈红色，外分泌组织不着色，对比非常鲜明，显示纯度在90%以上.碘丙啶-丫啶橙荧光染色，显示胰岛活率在90%以上.该方法在胰岛分离、提纯过程中为胰岛的鉴别和计数提供了非常简便、直观的方法.同时对胰岛分泌胰岛素进行检测显示，普通培养条件下1wk内分泌水平最高，3wk后所有胰岛分泌功能下降.
　　
　　结果显示，我们所制备的胰岛细胞在数量、纯度和功能及逆转高血糖方面显示出良好的状态.
　　参考文献:
　　
　　［1］Lim F，Sun AM.Microencapsulated islet as bioartificial en-docrine pancreas ［J］.Science，1980;210（21）:908-910.
　　［2］Lake SP，Anderson J，Chamberlain J et al.Bovine serum albu-min density.Gradient isolation of rat pancreatic islet ［J］.Transplantation，1987;43（6）:805-808.
　　［3］Field J，Farney A，Sutherland ERD.Improved islet isolation from rat pancreas using35%bovine serum albumin in combina-tion with dextran gradient separation ［J］.Transplantation，1996;61（10）:1554-1556.
　　［4］Hamelma W，Esmeraldo R，Gray DWR et al.A simple method for isolation of islets from the rabbit pancreas ［J］.Transplan-tation，1994;58（3）:390-392.