【关键词】 ，RT-PCR
关键词: RT-PCR;一步法
0 引言
传统RT-PCR方法需要用反转录酶将RNA先反转录成cDNA，然后用Taq酶对cDNA进行PCR扩增，而且往往需要巢式PCR扩增才能提高结果的特异性和灵敏度，操作比较麻烦.有人发现Taq DNA聚合酶有一定的反转录活性［1］ ，可以实现只用Taq DNA聚合酶进行反转录的单反应管一步法RT-PCR扩增.但是我们在实验过程中发现，利用Taq DNA聚合酶进行一步法RT-PCR反应成功率往往不高，这可能是因为Taq DNA聚合酶的反转录活性不高的原因造成的.为此，我们重新设计了实验方法，以提高用Taq DNA聚合酶进行RT-PCR的成功率.
1 材料和方法
1.1 材料 Thermolyne amplitronⅡPCR扩增仪（美国）;dNTPs（Promage）;Taq DNA聚合酶（Promaga，上海复华公司，澳大利亚金球公司）;20份HCV RNA阳性血清分别由我校西京医院检验科、西安铁路中心医院检验科、西安医科大学第二附属医院检验科提供，这些血清抗-HCV均为阳性;10份抗-HCV阴性血清，由西京医院中心血库提供.以上标本经传统的套式RT-PCR方法验证.
1.2 方法 PCR引物设计，针对HCV RNA5’端非编码区序列，用oligo软件对RT-PCR引物进行设计，HC1 :5’GTC AGT ATC TAT TCT AGA TGA CAG TGC CTG ATG GGG TGC TTG CGA GTG3’（黑线序列281～304）;HC2 :5’GTC AGT ATC TAT GCT AGA TGA CAG ATT CGT GCT CAT GGT GCA CGG TC3’（黑线序列344～322）;HC3 :5’GTC AGT ATC TAT TCT AGA TG3’;HC4 :5’GCG TTA GTA TGA GTG TCG3’（79～96）;HC5 :5’GCT CAT GGT GCA CGG TC3’（338～322）;探针:5’Bio-CCC CGG GAG GTC TCG TA3’（304～321）.上述HC1 ，HC2 引物划线部分为HCV RNA的序列，其余序列为相同序列，引物由中科院上海生物工程研究中心合成.主要标本处理过程按文献［2］进行.RT-PCR反应体系:取HCV RNA模板5μL于25μL反应液中（含dNTP各200μmol・L-1 ;HC1 ，HC2 各0.005μmol・L-1 ;HC3 1μmol・L-1 ，Mg2+ 1.5mmol・L-1 ，MnCl2 1.0mmol・L-1 ，100mmol・L-1 Tris-HCl，50mmol・L-1 KCl，Taq DNA聚合酶2U），扩增条件:首先94℃1min，62℃10min，然后94℃30s，62℃1min，72℃30s共循环5次，而后再改为:94℃30s，55℃30s，72℃30s共循环35次，最后72℃延伸2min，反应完毕，取10μL反应产物于20g・L-1 的琼脂糖凝胶板上电泳.传统的RT-PCR:具体方法按文献［3］. 2 结果
一步法短片段RT-PCR方法对20例HCV RNA阳性血清和10例HCV RNA阴性血清进行检测，前者都可扩增出120bp的预定产物，通过用Southern blot杂交检测，其为特异产物.而后者杂交结果为阴性，说明无特异性扩增带.用反转录能力确切的澳大利亚金球Taq DNA聚合酶，将短片段RT-PCR方法与传统用AMV反转录酶和Taq DNA聚合酶组成的一步RT-PCR方法的灵敏度作比较，两者所用的引物和血清样品都一样.不同的是传统方法用AMV反转录酶而一步RT-PCR方法用澳大利亚金球Taq DNA聚合酶.扩增条件除两者反转录步骤不同外，其他条件相同.结果对同一HCV RNA阳性血清的5个稀释梯度（1，10-1 ，10-2 ，10-3 ，10-4 倍）进行扩增，两者都能扩增出10-3 的梯度浓度.用引物HC4 ，HC5 取代短片段RT-PCR反应体系中的引物HC1 ，HC2 和HC3 对同一血清进行扩增，反应条件相同，结果3种Taq DNA聚合酶无一可以扩增出长片段RT-PCR产物，产物长度应为260bp;而短片段RT-PCR除Promaga Taq DNA聚合酶没有扩增出产物带外，澳大利亚金球公司和复华公司Taq DNA聚合酶可以扩增出120bp的产物.
3 讨论
本实验在建立方法的同时，也为了证实短片段RT-PCR是否比长片段有更大的成功率，以便今后用于其他DNA，RNA的检测实验.为了提高RT-PCR的实用性和成功率，我们对RT-PCR的引物进行改进，将上下游引物结合区的距离拉近（之间只有17个碱基），这样，加上HC1 引物结合区24个碱基，实际反转录过程只需要合成41个碱基的cD-NA即可，这对于反转录活性较弱的Taq DNA聚合酶是容易实现的，这样就提高了反转录的成功率.我们在上下游引物的5’端分别加了序列相同的尾，其序列是人为臆造的，长为24bp，这样既增大了产物的分子质量，便于电泳观察，又避免了相互之间形成二聚体.我们又设计了20个碱基长的引物HC3 ，其序列和前两个引物5’端的20个碱基序列相同，用于对HC1 和HC2 扩增产物的PCR扩增.
在RT-PCR程序设计上，首先进行62℃10min是使HC2 引物与RNA相应的部位结合，并在Taq DNA聚合酶作用下反转录合成cDNA，而后在退火温度为62℃1min循环5次，使HC1 ，HC2 两引物初步合成PCR产物，然后用55℃退火温度进行30次循环使HC3 引物能与初产物结合扩增产生大量的PCR产物.为了避免非特异扩增产物的出现，我们降低HC1 ，HC2 的浓度以消除二聚体的形成.如果将电泳检测PCR产物的方法改为杂交检测的话，就可以消除非特异性扩增产物的干扰，而且可以简化引物设计，大大缩短实验时间.
参考文献
［1］Grabko VI，Chistyakova LG，Lyapustin VN etal.Reverse tran-scription，amplification and sequencing of poliovirus RNA by Taq DNA polymerase ［J］.FEBS Lett，1996;387（213）:189-192.
［2］林万明.PCR技术操作和临床应用指南［M］.北京:人民军医出版社，1995:34-35.
［3］Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning:A lab-oratory manual ［M］.2nd ed.Cold Spring Laboratory Press，1989:683-684.